转录调控
您现在的位置:首页 >> 产品与服务 >>  核酸蛋白互作 >>  转录调控
GoldCLIP-seq整体服务
发布时间:2018-07-09 15:14:21 | 浏览次数:

      什么是CLIP-seq?

       CLIP-seq, 又称为HITS-CLIP,即紫外交联免疫沉淀结合高通量测序(UV crosslinking and immunprecipitation followed by high-throughput sequencing),是一项在全基因组水平揭示RNA分子与RNA结合蛋白相互作用的革命性技术,可深入揭示RNA结合蛋白与RNA分子的调控作用及其对生命的意义。

       相比于传统的RIP-seq(RNA Immunoprecipitation)技术来说,他们分别具有以下的优缺点(表1)。


表1  RIP和CLIP技术的优缺点比较

优点

缺点

RIP

步骤少,操作简单

背景高,有细胞裂解后核酸飘逸的问题存在导致假阳性高

CLIP

特异性高

交联效率低,步骤多,操作要求高



什么是GoldCLIP-seq?

传统的CLIP方需要利用进行放射性同位素标记示踪以及胶纯化回收RNA文库,实验步骤较为复杂,严重限制了该方法的普及应用。通过技术革新,表观生物隆重推出最新的GoldCLIP-seq(Gel-omitted and ligation-dependent CLIP-seq)技术服务。GoldCLIP通过利用Halo-tag的特性简化在体外纯化蛋白质和核酸复合物的步骤,从而省略了体外胶膜纯化蛋白RNA复合物的步骤。Halo-tag是经基因工程改造的脱卤素酶,其活性中心只能与含有卤素的配体以共价键的形式相互结合,而且该共价键不能打开。因此,当将靶蛋白和Halo标签融合后,含有Halo-tag的蛋白RNA复合物就可以与含有卤素配体的磁珠共价偶联。这样就能在体外进行严格地洗涤,去除背景,从而简化了胶膜纯化的步骤。Halo标签的分子量为33kDa,可以结合在靶蛋白的N端或者C端。该融合蛋白可以在原核或真核表达系统中表达。GoldCLIP的流程如图1所示。

图1  GoldCLIP-seq技术流程图

首先通过磁珠分离蛋白RNA复合物,然后在RNA的3’端加上接头,接着通过蛋白变性剂,如Urea,Guanidine,SDS等,对蛋白RNA复合物进行洗涤,最后得到高纯度的蛋白RNA复合物。然后降解蛋白,回收RNA。将RNA转录成cDNA后进行建库、测序、分析即可。


技术应用

1.    RNA结合蛋白作用机制研究

2.    lncRNA/circRNA功能机制研究

3.    miRNA靶标鉴定


技术优势

1.    不需要使用同位素示踪,省去了需要用到同位素的困扰

2.    所需细胞数量低于其他类型CLIP-seq

3.    省去了CLIP步骤中的胶回收步骤,极大提高了RNA的回收效率

 

送样要求

样本类型:1. 活细胞样本,密度≥1×107 ;

样本物种:仅限人、大小鼠,其他物种需评估。

其他注意事项:

1. 具备紫外交联仪的,可以把细胞交联收集好后通过干冰运输。

2. 不具备前期准备条件的,需提供活细胞及配套培养基,常温运输。如需进行细胞前处理,请提供详细说明和相关材料,并收取相应处理费用。细胞培养及收集需根据细胞类型不同而收取相应费用。


测序方案

1. 测序平台:Illumina HiSeq X10/Hiseq 4000

2. 测序模式:SE 50

3. 测序数据量: 20M-40M

 

生物信息分析内容

1. 数据产出统计,对原始测序数据去接头、去低质量 reads、去污染;

2. CLIP 测序序列与参考基因组序列的比对,Reads在全转录组的分布;

3. Reads在转录起始位点(TSS)附近的分布分析;

4. Reads在转录终止位点(TTS)附近的分布分析;

5. Reads在翻译起始位点(Start codon)附近的分布分析;

6. Reads在翻译终止位点(Stop codon)附近的分布分析;

7. 统计 CLIP 测序数据富集区域 ( Peak ) 的信息;

8. Peak 相关基因筛选与 GO 功能聚类分析及KEGG生物通路富集分析;

9. 多个样品的差异分析;

10.结合峰的motif检测。


案例:对RNA结合蛋白PTB的研究

多聚嘧啶区结合蛋白(polypyrimidine tract binding protein, PTB or hnRNP1)是一种在细胞内部参与mRNA代谢过程的蛋白质。PTB蛋白可结合于核酸分子上富含嘧啶碱基的序列,对mRNA前体的剪接进行调控。通过GoldCLIP-seq技术可以正确有效地找到PTB结合的mRNA序列,并且能富集出以富含CU碱基的motif。


参考文献

Gu, J., M. Wang, Y. Yang, D. Qiu, Y. Zhang, J. Ma, Y. Zhou, G. J. Hannon, and Y. Yu. "GoldCLIP: Gel-Omitted Ligation-Dependent CLIP." Genomics Proteomics Bioinformatics 16, no. 2 (Apr 2018): 136-43. (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29709556


 
 上一篇:irCLIP-Seq服务
 下一篇:TCGA数据挖掘服务—肿瘤相关RNA结合蛋白深度分析

关注我们

联系我们

邮箱:service@epibiotek.com
电话:020-89855770   400-775-0875
地址:广州市经济技术开发区国际企业孵化器E406

关于我们

       表观生物专注于医学表观遗传与转录调控研究领域,提供尖端的新一代测序技术服务和试剂盒开发,推动以表观遗传组学为基础的精准诊断与精准治疗的转化医学应用,造福人类健康。

版权所有:广州表观生物科技有限公司 粤ICP备16111092号