表观转录组研究方案
1.1 m6A修饰
m6A是一种动态可逆的修饰方式，在转录后调控中发挥作用,其在调控基因表达、剪接、RNA编辑、RNA稳定性、控制mRNA寿命和降解、影响蛋白翻译[1]等方面扮演重要角色，具有非常重要的研究意义。
图1. m6A的化学结构示意图
m6A甲基化修饰是由一个多蛋白复合物介导产生的（如图1），目前已知这个复合物的成分包括METTL3、METTL14和WTAP；而负责擦除甲基化修饰基团的是去甲基化酶FTO和ALKBH5。在细胞核中的 HNRNPC负责识别m6A修饰基团，并介导mRNA前体的选择性剪接（可变剪切）。而另外一个m6A识别蛋白HNRNPA2B1[2]则促进pri-miRNA加工成 pre-miRNA。
在细胞质中，不同的m6A位点识别蛋白（reader）介导不同的功能，涉及mRNA翻译、稳定性、剪接以及出核等方面。YTHDF1和YTHDF3[3]识别m6A修饰mRNA, 通过与起始因子及核糖体相互作用促进蛋白质翻译，eIF3识别蛋白也会直接绑定到mRNA 5'UTR 端的m6A位点参与翻译起始。而另外一个识别蛋白YTHDF2与m6A识别将导致mRNA的降解，而YTHDF3与YTHDC2也有类似的功能；而IGF2BP1/2/3则对翻译的稳定性有促进作用；YTHDC1与mRNA剪切以及出核相关。目前还存在其他未知的m6A识别蛋白，相关研究的继续开展将有利于解开m6A在mRNA运输、翻译和存储等功能方面的谜团。
图2. m6A修饰及相关因子[4]
1.2 ac4C修饰
N4-acetylcytidine (ac4C)，N4位乙酰胞嘧啶，是真核原核生物中保守的化学修饰，早期研究认为ac4C主要存在tRNA和18S rRNA上[6]。而近期研究显示，mRNA上也存在大量的ac4C，该修饰在促进蛋白翻译，影响RNA稳定性和可变剪接，调控基因表达发挥重要作用，有望成为表观转录组学的新兴发展方向[7,8]。而近期研究显示，mRNA上也存在大量的ac4C，其丰度甚至不低于mRNA携带的m7G帽子修饰[9,10]。NAT10是目前鉴定的唯一同时具有乙酰化酶结构域和RNA结合结构域的蛋白，因此被认为是RNA ac4C修饰酶。
图3. ac4C的化学结构示意图
2018年Arango等人的研究[11]首次揭示mRNA上存在大量ac4C修饰，并且ac4C影响mRNA的稳定性与翻译效率。
目前已鉴定到的核糖核苷修饰已超过140种，大量研究集中在tRNA和rRNA上，而mRNA上的化学修饰及其作用，研究尚处起步阶段。
2.1 研究目标
利用高通量测序技术/三代测序技术，在细胞水平上鉴定RNA修饰及其相关因子对该疾病的影响作用，并从RNA可变剪切、RNA翻译、RNA稳定性三个方面初步探究RNA修饰及其相关因子发挥作用的转录调控机制，再通过组织、细胞、动物水平的分子实验阐明RNA修饰相关蛋白及其介导的RNA修饰失调对疾病发生发展、诊断、治疗及预后的作用。
2.2 研究内容
2.2.1 初步探讨RNA修饰相关蛋白对疾病发生发展的影响
在未确定RNA修饰是否参与疾病发生发展的过程之前，我们首先对是否存在此机制，进行较全面的初筛和初探。
利用与疾病密切相关的细胞株，建立RNA修饰相关因子的敲除/敲降/过表达细胞模型，包括YTHDF1/2/3、FTO、ALKBH5、METTL3/4、YTHDC1、IGF2BP1/2/3。运用SLAM-seq高通量测序技术，对比对照组与敲除/敲降/过表达的转录组稳定性。敲除/敲降/过表达之后RNA稳定性出现显著变化，表明该基因在此过程中发挥着潜在的作用，提示RNA修饰可能通过改变RNA稳定性，影响着疾病的发生发展动态过程，值得深入验证此猜想。
2.2.2 疾病发生发展过程中转录组的RNA修饰鉴定
RNA修饰现象发生于RNA分子上，会发生RNA修饰水平的变化。
a. 运用meRIP-seq高通量测序技术，对正常细胞/组织与病理细胞/组织分别进行m6A甲基化修饰图谱的对比，获得差异m6A修饰位点信息，鉴定m6A修饰在病理过程的存在。
b. 运用acRIP-seq高通量测序技术，对正常细胞/组织与病理细胞/组织分别进行ac4C修饰图谱的对比，获得差异ac4C修饰位点信息，鉴定ac4C修饰在病理过程的存在。
2.2.3 初步解析RNA修饰对疾病发生发展相关基因的转录调控
2.2.3.1 RNA修饰对RNA翻译的影响分析
为了进一步阐明RNA修饰影响该疾病发生发展的机制，
2.2.3.2 RNA修饰对RNA可变剪切的影响分析
为了进一步阐明RNA修饰影响该疾病发生发展的机制，
2.2.4 在组织水平探究RNA修饰对疾病发挥作用的分子机制
2.2.4.1 临床组织样本中的RNA修饰相关蛋白表达情况的分析
利用RNA修饰相关蛋白的抗体，对正常人组织样本与疾病患者组织样本分别进行免疫组化（Immunohistonchemistry）分析，观察该蛋白在两者之间是否存在表达差异，鉴定该蛋白的疾病表达图谱。
2.2.4.1 临床组织样本中的RNA修饰相关蛋白与临床症状关联分析
将免疫组化的蛋白在正常与患者组织临床样本中的差异表达情况，与该病患的临床症状包括（肿瘤）分期、复发、侵袭/转移情况进行关联分析。样本数量大为宜。
2.2.5 在细胞水平探究RNA修饰对疾病发挥作用的分子机制
2.2.5.1 建立RNA修饰相关因子的功能缺失性细胞模型
利用与疾病密切相关的细胞株，将上述实验证明的可能在该疾病中发挥作用的RNA修饰相关因子进行敲降/沉默处理。
2.2.5.2 寻找RNA修饰相关基因的下游致病基因/治疗靶点
（1）沉默RNA修饰相关因子对疾病细胞的RNA修饰影响鉴定
a. 运用meRIP-seq高通量测序技术，对对照组与敲降组细胞分别进行m6A甲基化修饰图谱的对比，获得差异m6A修饰位点信息，预测被敲降的RNA修饰相关因子的下游重要致病基因/治疗靶点。
b. 运用acRIP-seq高通量测序技术，对对照组与敲降组细胞分别进行ac4C乙酰化修饰图谱的对比，获得差异ac4C修饰位点信息，预测被敲降的RNA修饰相关因子的下游重要致病基因/治疗靶点。
（2）下游致病基因/治疗靶点的验证
通过荧光定量RT-qPCR，在RNA水平，检测meRIP-seq/acRIP-seq分析预测的下游致病基因/治疗靶点，在对照组细胞和敲降组细胞上的RNA表达情况，是否因该基因的沉默而出现RNA水平的显著表达差异，验证被敲降的基因与预测靶点的关联性。
通过蛋白免疫印迹Western blot，在蛋白水平，检测meRIP-seq/acRIP-seq分析预测的下游致病基因/治疗靶点，在对照组细胞和敲降组细胞上的蛋白表达情况，是否因该基因的沉默而出现蛋白水平的显著表达差异，验证被敲降的基因与预测靶点的关联性。
2.2.5.3 建立RNA修饰相关因子的功能获得性细胞模型
利用与疾病密切相关的细胞株，将上述实验证明的可能在该疾病中发挥作用的RNA修饰相关因子进行过表达处理。
2.2.5.4 揭示RNA修饰相关因子及其介导的RNA修饰对疾病细胞的影响
（1）在疾病细胞株过表达RNA修饰相关因子之后，通过细胞流式分析仪，对对照组与过表达组细胞，分别进行PI染色，检测细胞周期检测，观察RNA修饰相关因子的过表达对细胞周期的影响。
（2）在疾病细胞株过表达RNA修饰相关因子之后，对对照组与过表达组细胞，分别进行细胞划痕实验（Scratch Assay）：在培养了单层贴壁细胞的培养皿上，用枪头在细胞生长的中央区域划线，划痕致伤，继续培养细胞，分别在0h、6h、12h、24h时间点在倒置显微镜下观察，观察RNA修饰相关因子的过表达对细胞的运动特性、迁移能力的影响。
（3）在疾病细胞株过表达RNA修饰相关因子之后，对对照组与过表达组细胞，分别进行细胞侵袭实验（Matrigel Invassion Assay），观察RNA修饰相关因子的过表达细胞穿过重建基质膜或Transwell小室的能力，了解该因子对细胞的体内侵袭转移能力的影响。
（4）还可以根据研究实际需求、疾病细胞株的特性选择进行MTT/CCK-8检测、克隆形成检测、细胞凋亡检测、细胞趋化实验等。
3.1 本项目的创新之处
（1）本项目从表观遗传学的角度，研究疾病发生发展过程中表观转录组学的变化，探究RNA修饰在此动态过程发挥的作用；
（2）探究RNA修饰调控转录调控的作用机理，从RNA稳定性、RNA翻译、RNA可变剪切的角度剖析RNA修饰对疾病病理的作用靶点。
（3）深入RNA修饰调控转录调控的作用机理，通过细胞功能获得性实验及功能缺失性实验，找到RNA修饰相关因子的下游致病基因/治疗靶点，揭示RNA修饰相关因子及其介导的RNA修饰对疾病细胞的影响，能为疾病发生发展、诊断、治疗、预后手段的提升提供新的思路。
3.2 拟解决的科学问题
从表观遗传学层面阐明该疾病的病理机制，挖掘疾病发生发展过程中关键的转录调控靶点基因，有望促进治疗药物、治疗手段的开发，或提高疾病早期诊断、预后评估手段的准确性。
图4. 表观转录组研究技术路径图
5.1 SLAM-seq
技术原理：向合成中的RNA链中掺入4-thiouridine (S4U)，使原本的碱基T被S4U修饰，从而在反转录中被错认为C，导致原本应该为碱基A的位置错配成为G。通过测序分析这些错配的G，就可以对新合成mRNA或其他longRNA进行直接的定量。
实验分组及样本要求：利用与疾病密切相关的细胞株，建立RNA修饰相关因子的敲除/敲降/过表达细胞模型，包括YTHDF1/2/3、FTO、ALKBH5、METTL3/4、YTHDC1、IGF2BP1/2/3，此为敲除/敲降/过表达组；与野生型细胞进行比较。1*106个细胞/每样本，在培养的活细胞中掺入S4U碱基。
分析内容：
1. 序列比对
2. 文库质控
3. Mapped Reads过滤
4. 背景T>C SNP校正
5. mRNA或longRNA*异表达分析
6. 靶基因GO富集分析
7. 靶基因KEGG富集分析
8. mRNA或longRNA转录本水平T>C counts计数与表达量化
9. mRNA或longRNA转录本水平Total reads计数与表达量化
10. mRNA或longRNA稳定性分析
11. mRNA或longRNA半衰期计算
* longRNA包括mRNA、lncRNA。
5.2 meRIP-seq
技术原理：基于抗体特异性结合甲基化修饰的碱基的原理，以RNA免疫共沉淀富集甲基化修饰片段为基础，然后通过高通量测序，在全转录组范围内研究发生甲基化的RNA区域，高效获得结果。
实验分组及样本要求：
a. 利用与疾病密切相关的细胞株，建立RNA修饰相关因子的敲除/敲降/过表达细胞模型，包括YTHDF1/2/3、FTO、ALKBH5、METTL3/4、YTHDC1、IGF2BP1/2/3，此为敲除/敲降/过表达组；与野生型细胞进行比较，每组3个或以上样本，5*106~107个细胞/每样本。
b. 正常人细胞/组织与疾病患者细胞/组织作为两组进行对比，每组3个或以上样本，5*106~107个细胞/每样本，或10~20mg组织/每样本。
分析内容：
1、 原始数据过滤及质控
2、参考基因组比对
3、Reads在染色体上的分布
4、Peak Calling 分析
5、Peak 可视化
6、Peak 统计分析
7、m6A 的基本特征
7.1 peak 在基因元件的分布
7.2 reads 在基因元件的分布
7.3 Peak 关联基因的特征
8、差异peak 分析
9、差异peak关联基因GO，KEGG分析
10、 motif分析
高级分析内容：
1. RNA-seq表达差异与m6A修饰差异关联分析
2. RNA可变剪切与m6A修饰差异关联分析
3. 翻译组RIBO-seq翻译差异与m6A修饰差异关联分析
5.3 acRIP-seq
技术原理：基于抗体特异性结合乙酰化修饰的碱基的原理，以RNA免疫共沉淀富集乙酰化修饰片段为基础，然后通过高通量测序，在全转录组范围内研究发生乙酰化的RNA区域，高效获得结果。
实验分组及样本要求：
分析内容：
1、Peak Calling 分析
2、Peak 可视化
3、Peak 统计分析
4、ac4C 的基本特征
4.1 peak 在基因元件的分布
4.2 reads 在基因元件的分布
4.3 Peak 关联基因的特征
5、差异peak 分析
6、差异peak关联基因GO,KEGG分析
7、 motif分析
高级分析内容
8、RNA-seq表达差异与ac4C修饰差异关联分析
9、mRNA可变剪切与ac4C修饰差异关联分析
10、翻译组RIBO-seq翻译差异与ac4C修饰差异关联分析
5.4 Ribo-seq
技术原理：利用低浓度RNase处理核糖体—新生肽链复合物，降解没有核糖体覆盖的mRNA片段，随后再去除核糖体，通过二代测序技术检测被核糖体保护的约22~30 bp的RNA小片段 (称为ribosome footprints，RFPs；又称ribosome protected fragments，RPFs。两者等价)，可得到核糖体分布的位置信息，据此可得到每种转录本上核糖体的分布、密度，可推测起始密码子位置（包括非ATG起始）、ORF（开放阅读框）位置、翻译暂停区域以及uORFs （上游开放阅读框）等信息[3]。
实验分组及样本要求：
利用与疾病密切相关的细胞株，建立RNA修饰相关因子的敲除/敲降/过表达细胞模型，包括YTHDF1/2/3、FTO、ALKBH5、METTL3/4、YTHDC1、IGF2BP1/2/3，此为敲除/敲降/过表达组；与野生型细胞进行比较，每组3个或以上样本，1*107个细胞/每样本。
正常人细胞/组织与疾病患者细胞/组织作为两组进行对比，每组3个或以上样本，1*107个细胞/每样本，或300mg组织/每样本。
5.5 Iso-Seq
技术原理：PacBio公司推出三代测序仪PacBio RSII，该平台采用单分子实时测序技术，以单分子实时测序反应（single-molecule real-time，SMRT）芯片为载体进行测序，三代测序数据具有读长（read）长（平均8-15kb左右）和无GC偏好性等特点，这些数据特征可以有力弥补了一代和二代测序技术的不足，从而使其具有广泛应用市场。而PacBio的异构体测序（ISO-Seq）采用长读取序列来测序长达10 kb的转录本异构体，是近年来三代测序在RNA领域的热点。其平均读长8-15Kb，可以轻松跨越从 5´末端到 3´-Poly A tail 的完整转录本，从而准确鉴定异构体，可实现对可变剪切(Alternative Splicing, AS)、可选择性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation,APA)、可变转录起始位点（Alternative Transcription Start Sites ,ATSS）、融合基因鉴定、ORF/NMD预测、CDS预测、新转录本发现、功能注释，差异表达和功能多样性分析等内容。
传统二代测序技术分析上，对基因表达数据的功能分析是基于比对的基因而非以转录本为中心，因此短读RNA-seq的解析存在严重局限性，不足以揭示基因表达功能与转录后调控机制，而ISO-Seq测序提供了全新的方法方式去探索RNA世界。
技术优势：
三代测序无需组装可获得准确度大于99%的高质量转录本（HQ high-quality isoforms）
使用最新Iso-Seq3分析流程，获取最新分析手段
使用最新的全长转录本的功能分析（FIT Functional Iso-Transcriptomics analysis)
数据分析多种选择，定制分析内容
实验分组及样本要求：
利用与疾病密切相关的细胞株，建立RNA修饰相关因子的敲除/敲降/过表达细胞模型，包括YTHDF1/2/3、FTO、ALKBH5、METTL3/4、YTHDC1、IGF2BP1/2/3，此为敲降组（沉默组）；与野生型细胞进行比较，每组3个或以上样本，5*106~1*107个细胞/每样本，或20ug Total RNA。
正常人细胞/组织与疾病患者细胞/组织作为两组进行对比，每组3个或以上样本5*106~1*107个细胞/每样本，或10mg组织/每样本，或20ug Total RNA。
分析内容：
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