m⁶A是在真核细胞mRNA中最普遍存在的修饰，需由阅读器 (reader) 识别 (比如YTH结构域蛋白)，调控mRNA的命运。近日，中山大学杨建华教授团队、辛辛那提大学陈建军教授以及芝加哥大学何川教授团队等合作，发现IGF2BP蛋白 (胰岛素样生长因子2 mRNA 结合蛋白) 是一种独特的m⁶A阅读器，它不像YTH结构域家族蛋白那样促进mRNA降解，而是使mRNA更稳定！咱们来看看他们是如何发现这种新reader的：

发现IGF2BP是m⁶A结合蛋白

研究者通过两个方法，筛选m⁶A结合蛋白：1. 使用甲基化的单链RNA诱饵 (ss-m⁶A，共有序列为GG(m⁶A)CU)，对照组为未甲基化的RNA (ss-A)，进行RNA pull-down和质谱分析；2. 利用自主研发的一个新计算流程：基于已发表的RBP CLIP-seq (紫外交联免疫共沉淀测序) 数据库和已知的m⁶A修饰位点，筛选出潜在m⁶A结合蛋白。

a.质谱分析表明3种IGF2BP蛋白与ss-m⁶A结合。b.计算结果表明这3种IGF2BP在112个显著的RBP里面排前15。c. FLAG-IGF2BP上富集有m⁶A修饰。d. 对比RIP-seq结果和已发表的PAR-CLIP数据，找到3种IGF2BP蛋白的高可信度靶基因。

通过这种方法，研究者鉴定得IGF2BP为m⁶A结合蛋白。

 

 

发现IGF2BP能使靶基因更稳定

为探究IGF2BP的作用，研究者进行了功能缺失实验，即敲降IGF2BP，进行RNA-seq，发现靶基因的表达因此减少：

CLIP组靶基因 (CLIP数据所示的靶基因) 表达被抑制，特别是CLIP+RIP组靶基因 (RIP-seq与CLIP数据重叠的靶基因)。

IGF2BP的这个功能否受胞内m⁶A水平影响呢？降低m⁶A水平，常用的方法是敲降甲基转移酶METTL3或METTL14 ；研究者敲降HepG2细胞的METTL14后，进行m⁶A-seq和RNA-seq，发现有1,516个基因的m⁶A修饰相应减少，其中有418个基因的mRNA水平下降，而IGF2BP的高可信靶基因都在此列，下调显著。IGF2BP和METTL14的关联表明IGF2BP与m⁶A调控的基因相关。

d. HepG2细胞敲降METTL14后的m⁶A水平与基因表达水平，两者均下降的418个基因即为m⁶A-Hypo-down组；e. shMETTL14细胞中IGF2BP高可信靶基因的mRNA log2 FC累积频数；f. METTL3或METTL14沉默后FSCN1、TK1、MARCKSL1 和MYC mRNA水平。

研究者敲降了细胞的IGF2BP3，检测mRNA稳定性，发现IGF2BP3和CLIP的高可信度靶基因的中位半衰期都显著缩短了将近一半！

还有哪些因子共同增强mRNA的稳定性呢？研究者对IGF2BP2复合物进行了pull down与质谱分析，发现存在着ELAVL1 (也叫HuR)，MATR3和PABPC1，这3个都是已知的mRNA稳定剂（mRNA stabilizers）。以上结果表明IGF2BP2有助于其靶基因稳定翻译。

发现m⁶A对IGF2BP的作用

MYC是IGF2BP1的靶基因，研究者发现m⁶A修饰在MYC上积累，且m⁶A的峰与IFG2BP结合位点一致；CRD区 (不稳定编码区) 的m⁶A修饰丰度很高，且在METTL14敲降后显著减少；通过RIP和基因特异m⁶A实验，研究者证明CRD区域内存在IGF2BP结合、m⁶A修饰、METTL3和METTL13的结合：

a, m⁶A-seq和RIP-seq所得的MYC mRNA与m⁶A峰的分布图 ；b, RIP–qPCR显示MYC CRD中的FLAG-tagged IGF2BPs；c, gene-specific m⁶A qPCR实验检测MYC CRD的m⁶A修饰 ；d, RIP–qPCR 显示METTL3和METTL14 结合到m⁶A CRD. e, RNA pull down，分别用有m⁶A或者没有m⁶A修饰 (即图中“A”实验组)的CRD1、CRD2来拉IGF2BP。

接下来，研究者利用荧光素酶报告实验，检测突变CRD序列之后IGF2BP的表达情况；联合RIP-qPCR实验，证明CRD的m⁶A修饰对IGF2BP结合到MYC以及调节MYC表达是必需的。研究者还发现KH3-4双结构域对IGF2BP与带m⁶A修饰的mRNA的结合，以及调控靶基因有着重要的作用。

 

验证IGF2BP的致癌作用

Cancer Genomics cBioPortal与TCGA的数据显示，3种IGF2BP在多种肿瘤中均有异常高表达，联系本研究中它们对致癌基因如MYC的稳定作用，研究者推测IGF2BP具有致癌作用，于是他敲降了HeLa和HepG2细胞的IGF2BP，结果抑制了这些肿瘤细胞的增殖、克隆形成能力和细胞迁移/侵袭，效果如同沉默MYC；利用CRISPR-Cas9技术敲除IGF2BP，再添加KH3-4突变的IGF2BP进行挽救实验，证明IGG2BP的致癌功能依赖于KH3-4，即m⁶A reader。

Epi老师：值得一提的是，NCB杂志同期还配发了题为“An additional class of m⁶A readers”的评述文章，对该工作给予了高度评价。这项研究鉴定得新的m⁶A识别蛋白家族IGF2BP1/2/3，并且发现它有着与已知的YTH结构域蛋白有着截然不同的功能，拓宽了我们对m⁶A识别蛋白的机制和功能的认识。Epi老师相信这个新发现会让m⁶A研究进一步升温！

图为3类m6A识别(reader)蛋白。a, 第一类，YTH结构域(蓝色显示)蛋白，与m6A(红色显示)直接结合。b, 第二类，利用m6A开关机制与含m6A的转录本结合：RNA的m6A修饰会破坏碱基互补配对，提高单链RNA基序的可进入性，从而被m6A识别蛋白识别(绿色显示)。RNA基序可以与m6A位点重叠。这类识别蛋白有hnRNPC、hnRNPG，hnRNPA2B1也可能属于这类蛋白。c, 此研究新发现的一类识别蛋白，利用共有的RNA结合结构域(RBD)及其侧翼区(绿色显示)来识别含m6A的转录本。这类识别蛋白包括IGF2BP，利用KH结构域及侧翼区来选择性结合含m6A的RNA；hnRNPA2B1也有可能属于这类蛋白，它的RRM及侧翼区可能有助于m6A选择。

原文: Huang H, et al. Recognition of RNA N⁶-methyladenosine by IGF2BP proteins enhances mRNA stability and translation. Nat Cell Biol. 2018 Mar;20(3):285-295.  PMID: 29476152

杨建华教授个人简介

杨建华教授，中山大学博士生导师，长期致力于开发新算法、平台和实验方法研究非编码RNA基因和RNA修饰及其互作蛋白的结构、功能和作用机制。以通讯作者或第一作者身份在Nature Cell Biology、Cell Research、Nucleic Acids Res.、Cell Reports等杂志发表20多篇研究论文，以合作者身份在Nature Methods、Cell Stem Cell等杂志发表10多篇研究论文。开发starBase、starScan、snoSeeker和ChIPBase等工具被Nature等杂志引用超过1200次，受邀在Springer出版社出版了3篇关于非编码RNA研究方法的论著章节。目前担任Non-coding RNA杂志的编委。

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