相信exosomes研究者们，都接触过一个有趣的词：“特洛伊外泌体”。为什么外泌体会和古希腊的著名战争有关系？今天Epi老师来跟大家科普一下。

1   The Trojan Exosomes Hypothesis

在古希腊传说中，希腊联军围困特洛伊久攻不下，于是假装撤退，留下一具巨大的中空木马，特洛伊守军不知是计，把木马运进城中作为战利品。夜深人静之际，木马腹中躲藏的希腊士兵打开城门，特洛伊沦陷。

提到特洛伊木马，比起那场战争，咱们更容易想到的是电脑病毒。exosomes与特洛伊的渊源，还真的跟病毒有关系。

早在2003年，主要研究HIV病毒的Gould和Hildreth，就提出了“特洛伊外泌体假说”（The Trojan exosomes hypothesis）1。这个假说提出，逆转录病毒 (retroviruses) 利用细胞间囊泡通讯、exosomes的运输，生成逆转录病毒粒子，并作主要的侵染活动。利用Trojan exosomes假说，就能够很好地解释逆转录病毒的一些特征：逆转录病毒特有的脂质组分是如何进行传播的，宿主细胞的蛋白为什么会出现在逆转录病毒粒子中，逆转录病毒释放的复杂细胞生物过程，以及逆转录病毒为何在没有包膜蛋白、没有受体的情况下，还能够感染细胞。不光如此，Trojan exosomes假说还有一个更大胆的假设：逆转录病毒正是从exosomes演变而来的（exosomal origin）！所以在2003年，Gould就根据这个假说预测说：逆转录病毒就是适应性免疫应答的一个悖论，逆转录病毒抗体疫苗不能提供预防保护，自身免疫才是抗逆转录病毒免疫的关键。

15年后的今天，针对最广为人知的逆转录病毒——HIV的成熟疫苗仍未面世。多个艾滋病疫苗，都被扼杀于临床试验阶段。如默克公司的MRK Ad5方案，通过了前期测试，但是在大规模研究中显示，会增加受试者 HIV 感染风险，最终在2007年宣告失败2；又如RV-144疫苗，这种疫苗由美国和泰国联合研究，从2003年开始实施，2009年宣布了实验结果：降低了31%的艾滋病感染风险³。这个结果当然不能令人满意，但已经是至今为止，距离成功最近、走的路程最远的一次了。目前强生公司的HIV疫苗试验已顺利完成II早期试验，给我们种下一颗希望的种子。

所以在上个月，Hildreth本人也在Front Immunol上发文重提了当年的Trojan exosomes假说⁴。他指出，把HIV当作exosomes来研究，或许是研发HIV疫苗的一个好办法。

2  Exosomes与逆转录病毒

那么这个大胆的假说具体怎么说的呢？首先，exosomes与逆转录病毒的相似点多得真的有点过分：

1. 形态学和生理学：形态上，exosomes和逆转录病毒是相似的颗粒，双层脂膜，直径为100~200 nm；生理学上，两者的胆固醇、糖鞘脂都比细胞质膜高^5.6；HIV-1和T细胞分泌的exosomes，都有多糖外衣⁷，也有一样的质膜蛋白 (如tetraspanins, 补体, MHC)，胞浆蛋白 (actin, tsg101, 热休克蛋白)⁸、宿主蛋白⁹。感染HIV病毒后，细胞分泌出来的exosomes，也整合有病毒蛋白，比如Nef蛋白通过exosomes转运¹⁰。

2. 形成和释放途径：exosomes和HIV都可通过MVB（即多泡体，也是一种晚期内体）途径，借助ESCRT机制生成和释放。 

3. 传播途径：exosomes可通过内吞途径被受体细胞吸收，这个过程中会发生细胞受体、ICAM1、脂酰丝氨酸以及其他exosomes表面分子的相互作用¹¹；而在HIV-1出芽时，也会整合进宿主的ICAM1¹²，脂酰丝氨酸也在HIV-1侵染单核细胞时发挥着作用。来源于DC细胞的exosomes有着免疫作用，携带抗原的exosomes能刺激抗体特异性CD4⁺ T细胞和CD8⁺T细胞激活⁸；相似地，DC细胞可以不依赖包膜的途径捕获HIV，随后HIV可以向CD4⁺ T细胞和CD8⁺T细胞呈递抗原¹³。

Exosomes与HIV在生化组分、形成和释放方面的相同点

有鉴于此，Gould提出，逆转录病毒在进化过程中，发展出了利用宿主细胞固有的exosomes形成和释放途径，产生感染性病毒颗粒；利用MVB进行生成和释放的能力，从而逃避宿主免疫；利用exosomes被受体细胞吸收的途径，形成不依赖于包膜蛋白的、非受体介导的感染模式，感染其他细胞。这个假说当年从全新的角度诠释了逆转录病毒的进化、生物起源、感染和传播的机制，较为合理地揭示了逆转录病毒一些重要的生理学和免疫学特性。

也就是说，病毒“挟持”了exosomes，利用它进入了宿主细胞、敌人内部，exosomes就如同那只木马，大摇大摆地进了城门，而病毒的分子，如mRNA (HCV的RNA¹⁴、HIV的Gag¹⁵)、miRNA (EBV的miRNA¹⁶)、蛋白 (HIV的Nef¹⁰) 甚至是整个病毒粒子 (HCV)，在exosomes的掩护下顺利进入宿主细胞后，就从exosomes释放出来，发挥功能，协助病毒侵染、复制，宿主细胞沦陷。现在，越来越多的证据支撑了这个假说，所以特洛伊外泌体这个名词出现得也越来越频繁，广为人知了。

而至于假说中提到的另一个更大胆的假设：exosomes就是逆转录病毒的祖先，逆转病毒正是由exosomes进化而来的，这一点目前我们就不得而知了。想必Izquierdo-Useros对此也感到困惑，不然也不会给他的综述起这样的题目： Exosomes and retroviruses: the chicken or the egg?

3   Cell: 逆转录病毒样蛋白与EV

以上就是exosomes被比喻为Trojan horse的由来。为什么Epi老师突然给大家讲这个？因为上周Cell 同期发布了两篇EV与逆转录病毒蛋白Gag类似的Arc蛋白研究。不要小看逆转录病毒和转座子，这些蛋白和我们是息息相关的。有人这么描述转座子：基因组从出现就一直在经历一场和转座子及逆转录病毒的战争。真核生物的基因组到处是这场战争留下的疤痕，比如人类的基因组有45%的序列都跟转座子有关，且其中大部分转座子来源的基因都在大脑表达。

这两项研究的对象都是神经元基因Arc，它与突触的可塑性以及CNS疾病相关，比如阿兹海默病、精神分裂症等。Arc与逆转录病毒Gag样蛋白有着类似的结构域，进化上同源。其中一篇Cell 来自于美国犹他大学的Pastuzyn等人¹⁷，研究主要使用HEK细胞、小鼠模型来源的原代神经元细胞，发现Arc蛋白通过EV从神经元细胞中释放；除了Arc蛋白，EV同时也可以将Arc mRNA转运到另一个细胞，并在这个细胞内翻译表达，表明Arc就像逆转录病毒的Gag蛋白，还能整合进病毒样衣壳中； Gag逆转录因子在进化过程中被重新用于神经系统中的细胞间通讯。

神经元基因Arc编码类似逆转录转座子Gag的蛋白，介导RNA胞间转运

来自于马萨诸塞大学医学院的Ashley等人¹⁸研究的是果蝇的Arc1蛋白，同样可构成衣壳样结构，它和darc1 mRNA一起转载到EV，从运动神经元转运到肌肉，有意思的是，为什么EV不仅转运发挥功能的蛋白，还要转运它的mRNA？Ashley发现，EV对Arc1的转运依赖于darc1-mRNA3'非翻译区，它含有逆转录转座子样序列，中断这个转运的话，会破坏突触的可塑性。

逆转录病毒样Gag蛋白Arc1结合RNA，进行跨突触运输

这两篇文章找到了神经元间转运的新途径：EV。正如Trojan exosomes假说所言，逆转录病毒能把自己的功能分子（比如Gag蛋白）打包进exosomes进行运输，这已经不是什么新鲜事，但没想到哺乳动物中的类Gag蛋白也有这种操作；Arc蛋白本身就对神经系统有着重要作用，无独有偶，现在也越来越多关于EV与神经系统疾病的报道。此外，目前exosomes的重量级研究主要倾向于探索exosomal miRNA（点击回顾2017外泌体重量级文章），而这两篇文章都提出了exosomal mRNA的重要性，它除了能在靶细胞进行蛋白翻译，还对exosomes的转运具有调节作用，这向exosomes研究者们发出了一个信号：外泌体，不止miRNA：其他类型的RNA分子同样具有潜在的功能，有待挖掘。

参考文献：

1. Gould SJ,et al. The Trojan exosome hypothesis. PNAS. 2003 Sep 16;100(19):10592-7.

2. 顾觉奋. 艾滋病疫苗的研究进展: 挑战和曙光[J].中国新药杂志, 2014, 20: 019.

3. BOSELEY S, et al. HIV breakthrough as scientists discover new vaccine to prevent infection[J]. The Guardian, 2009.

4. .Hildreth JEK, et al. HIV As Trojan Exosome: Immunological Paradox Explained? Front Immunol. 2017 Dec 1;8:1715. 

5. Aloia, R.C., et al .Lipid composition and fluidity of the human immunodeficiency virus envelope and host cell plasma membranes. Proc Nat AcadSci USA 1993 90: 5181–5185.

6. Wubbolts, R., et al. Proteomic and biochemical analyses of human B cell-derived exosomes.Potential implications for their function and multivesicular body formation. JBiol Chem 2003 278: 10963– 10972. 

7. Krishnamoorthy, L., et al. HIV-1 and microvesicles from T cells share a common glycome, arguing for a common origin. Nat Chem Biol 2009 5: 244–250. 

8. Théry, C., et al. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat Rev Immunol 2: 569-579

9. Nguyen, D.G., et al. Evidence that HIV budding in primary macrophages occurs through the exosome release pathway. J Biol Chem 2003 278: 52347–52354.

10. Lenassi, M., et al. HIV Nef is secreted in exosomes and triggers apoptosis in bystander CD4+ T cells. Traffic 2010 11: 110–122. 

11. Théry, C., et al. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol 2009 9: 581–593. 

12. Tardif, M.R., et al. Presence of host ICAM-1 in human immuno deficiency virus type 1 virions increases productive infection of CD4+ T lymphocytes by favoring cytosolic delivery of viral material. J Virol 2003 77:12299–12309.

13. Izquierdo-Useros, N., et al. Maturation of blood-derived dendritic cells enhances human immunodeficiency virus type 1 capture and transmission. J Virol 2007 81: 7559–7570. 

14. Ramakrishnaiah V, et al. Exosome-mediated transmission of hepatitis C virus between human hepatoma Huh7.5 cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2013,110(32):13109-13113.

15. Columba Cabezas S, et al. Sequences within RNA coding for HIV-1 Gag p17 are efficiently targeted to exosomes.Cell Microbiol. 2013 Mar;15(3):412-29.

16 Meckes D G Jr, et al. Human tumor virus utilizes exosomes for intercellular communication[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2010,107(47):20370-20375.

17. Pastuzyn E D, et al. The Neuronal Gene Arc Encodesa Repurposed Retrotransposon Gag Protein that Mediates Intercellular RNA Transfer. Cell 2008, 172, 275–288. 

18. Ashley J, et al., Retrovirus-like Gag Protein Arc1 Binds RNA and Traffics across Synaptic Boutons . Cell 2018, 172, 262–274.

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