许多技术可用于在染色质上定位某个RNA，比如ChIRP、CHART和RAP-DNA，它们利用互补序列捕获特定的RNA，然后进行高通量测序，找出染色质靶点，但是这些方法每次只能研究一个已知的RNA，不能研究全基因组范围上全部的RNA-染色质相互作用。

       RNA在调节基因表达时还有协调功能DNA元件的作用。我们可以通过Hi-C分析染色质结构，检测所有可能的DNA-DNA相互作用；通过ChIA-PET分析特定因子介导的染色质相互作用，但是这些技术检测的主要都是非细胞类型依赖的拓扑相关结构域 (TAD) 内的，而染色质上的RNA还可能帮助我们找到转录活性相关的相互作用，帮助我们区分超级增强子和普通增强子。

       为了解决上述问题，来自加州大学的付向东研究团队，研发了一种无偏差地检测全部染色质-RNA相互作用的技术——GRID-seq。接下来，Epi老师将和大家一起了解这项振奋人心的新技术。

01 GRID-seq技术原理

      研究者首先选用了三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231，构建无偏差的全基因组RNA-染色质相互作用图谱。GRID-seq方法原理如下图：

1. 预先设计特殊的linker，一端是单链RNA，另一端是双链DNA 

2. 用DSG和甲醛固定RNA-DNA相互作用，提取细胞核。 

3. 用AluI 进行酶切

4. 加入linker，linker的RNA与要捕获的RNA连接

5. 反转录，扩增连接的RNA

6. 去除游离的linker

7. linker的DNA与要捕获的DNA连接）

8. 用整合素磁珠捕获DNA

9. 从磁珠释放ssDNA，合成dsDNA，使用MmeI，将linker上设计好的酶切位点切开

10. 跑胶，得到两个DNA片段，85bp的是连接了RNA和DNA的linker，65bp的是只连接了RNA或者DNA的linker。

对人和果蝇基因组的测序结果都表明GRID-seq更倾向于检测染色质上的新生RNA。

将GRID-seq结果与RNA-seq (c) 以及GRO-seq (d) 比较，发现它与后者检测到的新生RNA相关性更高。 

 为了排除非特异性的相互作用，研究者构建了一个鉴定特异性相互作用的背景模型： 

研究者使用人MDA-MB-231、果蝇S2细胞以及组合来构建文库。结果如g图所示，跨物种的结合较少。运用这些交叉物种的reads，研究者可利用小的果蝇基因组 (这样人RNA的read数目就会更多) 来构建一个真正的非特异RNA-染色质相互作用背景 (h图上图第一行) 。接下来，研究者用同一种细胞的mRNA-染色质相互作用做内源背景 (第二行)，发现预测的内源背景与外源背景高度一致。

02 GRID-seq数据展示

        对GRID-seq作了背景优化之后，数据质量如何呢？

a. 热图显示，在MDA-MB-231细胞中只有少量的RNA与基因组发生反式相互作用；b. 第11条 (左) 和第17条 (右) 染色质上的RNA相互作用情况，可见MALAT1和NEAT1等与染色质上的几个位点相互作用；c. 对果蝇S2细胞的GRID-seq热图显示，roX2 RNA与果蝇X染色质的相互作用；d-f. 将GRID-seq数据与已公布的roX2 ChIRP、CHART数据以及MSL3的ChIP-seq数据相比，十分一致；g-i. 富集染色质的RNA的鉴定峰三角图，分别是人MDA-MB-231细胞，mESC细胞和果蝇S2细胞。

      这些数据表明，通过GRID-seq技术能发现已知的特异RNA-染色质相互作用，并具有高特异性、高敏感性的特点。但是与关注单一靶标的捕获技术相比，有着all-to-all 特性的GRID-seq使每个与染色质相互作用的RNA的读数更少。

03 细胞类型特异的相互作用

       GRID-seq检测的RNA-染色质相互作用是否为细胞类型特异的呢？研究者对MDA-MB-231和MM.1S细胞 (人多发性骨髓瘤细胞株) 进行联合分析，发现富集染色质的RNA主要都是细胞类型特异的。

e. 除了未注释的DNA元件，RNA相互作用都以细胞类型特异的方式富集于活性启动子和增强子；h. 许多共有的捕获RNA，比如FAM49B RNA，在两种细胞中有着相似的染色质相互作用丰度，但是与不同的增强子有联系。

04 超级增强子上的RNA

       RNA会作用于活性增强子，那么GRID-seq信号能不能反映普通增强子和超级增强子的强度差异呢？研究者用RNA相互作用水平为标准，给10,567个含有H3K27ac标签的活性增强子排序，并比较了超级增强子和普通增强子的染色质富集RNA的密度分布，结果如下： 

与RNA高度关联的增强子，正是MDA-MB-231和MM.1S细胞中的超级增强子(a)，定量分析的结果也能证明这一点(b)。因此，染色质相互作用的RNA可成为鉴定超级增强子的条件。 

05 RNA-染色质相互作用与TAD

       基因组学的一个基本问题是，在细胞核的三维空间中，不同的DNA分子是如何相互作用的，现有的Hi-C和ChIA-PET技术就应用于研究这个问题。但是，Hi-C或者RNAPII ChIA-PET，难以将活性转录基因和非活性或转录上静止的基因区别开来。Hi-C检测的是全部类型的DNA-DNA相互作用，而GRID-seq捕获的是只生成RNA的基因 (RNA-producing genes ) 与DNA元件的相互作用，所以研究者选取了Hi-C单个基因的部分与GRID-seq的数据作比较：

GRID-seq和Hi-C的Pearson相关系数表明它们有着高度一致性 (d)，mESC细胞样本实验结果也证实了这一点 (e)。 

       这种相似性表明，染色质与RNA的相互作用主要存在于细胞核的高级结构中，GRID-seq可应用于预测与RNA生成有关的基因组相互作用，作为现有的3D基因研究技术的补充。 

06 启动子与增强子的联系

       研究者进一步运用GRID-seq研究转录相关的基因组相互作用，研究一个悬而未决的问题：增强子和活性启动子如何在3D基因组中联系？ 

a. 研究者通过Cytoscape的self-organized布局，将启动子-启动子和启动子-增强子的网络直观化。b. 计算启动子-启动子和启动子-增强子相互作用，发现每个启动子关联的RNA最多可达4个，表明一个基因的启动子可能作为其他基因的增强子。c. 每个富集染色质的RNA能与多种普通增强子相互作用，但只和一两个超级增强子发生相互作用。d. 相反，无论普通或者超级增强子，大部分都与一个或两个基因来源的RNA相互作用。e. MM.1S细胞上，与超级增强子有关联的基因，对BRD4抑制剂JQ1干扰的敏感性会比只与一个普通增强子有关系的基因高。f. 用mESC细胞做类似的实验，在删除Mediator后，超级增强子作出的转录应答也更敏感。g. 利用GRID-seq和Cytoscape绘制全基因组相互作用网络，揭示单个染色体的结构，类似染色体涂染技术检测到的核领域。

      上述结果表明，在很多增强子控制一个基因的同时，每个增强子，无论是普通还是超级增强子，还调控着一系列高度特异的靶基因；另外，尽管研究者检测到的不同染色体之间的启动子-启动子联系极少，但是确实观察到染色体间的特异相互作用。接下来的工作，需要进一步验证这些预测到的染色体间相互作用，特别是在单细胞水平，这有助于了解细胞核3D空间的基因组结构。

07 讨论

       GRID-seq技术通过特殊设计的二价linker连接RNA和DNA，能实现对RNA-DNA相互作用的检测和分析。这项研究中展示的人和果蝇细胞的GRID-seq数据，表明少部分RNA可广泛参与反式染色体相互作用 (trans-chromosomal interactions)。 

       越来越多的数据表明，lncRNA和新生RNA都参与了染色质上一系列的调控过程，比如募集RNA依赖性的DNA甲基转移酶、转录激活剂或抑制剂。因此，GRID-seq技术的诞生，有望帮助我们发现更多RNA介导的调控活动。

原文：Li X, et al. GRID-seq reveals the global RNA-chromatin interactome. Nat Biotechnol. 2017 Oct;35(10):940-950.