在刚过去不久的6月底，Cell 期刊同时发表了两篇研究lncRNA TERRA的文章，一篇是关于TERRA如何实现优先修复短端粒的机制，国内众多生物媒体均对此研究进行了报道。今天，Epi老师和大家谈的是和它一起发表的另一篇TERRA文章。

这篇标题为 “TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres” 的文章，主要就是发现了TERRA不仅与端粒结合，还与端粒以外的染色体结合，并且影响附近基因的转录，保护端粒完整性。这么说来好像很简单，RNA和染色质的相互作用，做做FISH，做做pull down不就好了？But，咱们的研究对象可是TERRA，TERRA有着高度重复的序列，所以不能用普通的覆瓦式(tiling)探针，一般来说ChIRP用的就是一组tiling核苷酸探针；特异位点TTAGGG在所有染色体末端都存在，又会很容易把端粒DNA拉下来而不是想要的TERRA RNA，造成高背景。那么作者是怎么解决这些技术问题的呢？我们一起来看一下吧。

1. CHIRT-seq

作者将现有的ChIRP和CHART (capture hybridization analysis of RNA targets) 技术结合，发明了一项新技术并命名为CHIRT，用以捕获染色体上的TERRA结合位点：

图中分别是三种技术的流程图。ChIRP使用的是一组全链覆盖式探针（又称平铺探针）；CHART使用的互补核酸探针数量较少，序列较长。作者将两者结合，并做了优化：在CHIRT中使用了一个单独的核酸探针，靶向端粒重复序列，与多探针相比，脱靶的可能性减少；剪切强度减弱，保护lncRNA；将RNaseH洗脱使用的buffer改为NP40，保护RNaseH活性；建库前设置spike-in对照DNA，作为内参。更多的技术对比可见本文末延伸阅读。

通过CHIRT提取到TERRA基因结合位点，进行测序，再配合CEAS软件分析，TERRA RNA FISH验证，作者证实了他的猜想：TERRA不仅仅与端粒结合，还和邻近的其他基因结合。

2. LNA GapmeR

除了CHIRT，本文还有一个技术亮点。在此之前，对TERRA的研究一直苦于缺乏合适的工具，删除TERRA的效果也不是很稳定，因为TERRA是从必需的端粒结构转录而来的，无法进行基因敲除；而且TERRA高度重复，序列还与端粒相似，很难使用RNA干扰方法。

于是作者使用了特殊锁核酸 (LNA) 化学修饰的，并添加了gapmer设计的单链ASO，使之更适合用于RNaseH介导的TERRA转录本体内降解。切割TERRA后做RT-qPCR和RNA-seq，发现TERRA对它的靶基因有负调节作用。解决了这两个技术难题，接下来各种实验都可以顺利开展了。

A. Northen blot，B.RNA FISH，检测LNA gapmer切除效果；C & D，将RNA-seq数据做成累积频数图 (C) 和Bland-Altman散点图 (D)；E.切割TERRA后进行RT-qPCR。

3.相互作用蛋白研究

不严谨不Cell，作者还嫌一般的蛋白质组研究常常提取到hnRNP等RNA结合蛋白，所以用了iDRIP (identification of direct RNA interacting proteins) 技术,做定量质谱，获得TERRA蛋白相互作用组 (interactome)，发现了134个新的TERRA蛋白伴侣，涉及很多不同的细胞过程。

作者将自己的CHIRT数据与前人的ESC ChIP数据做比较，发现ATRX与TERRA的结合浓度最高，顺理成章地选了ATRX作为研究对象，进行了更多的实验：

a.  ChIP、siRNA、metagene分析显示，TERRA的结合对ATRX的靶基因有正调节作用，与ATRX的作用是相反的，两者是拮抗的。

b. EMSA检测到TERRA和ATRX直接相互作用；ATRX免疫染色和端粒DNA FISH发现TERRA通过竞争结合到端粒DNA，调控ATRX的端粒定位。

RNA EMSA。A图，ATRX蛋白使TERRA RNA迁移，表明两者直接结合。B图，添加双链或单链的端粒重复序列，都没有竞争掉ATRX与TERRA的相互作用。 B, 结合探针(shifted)；U, 未结合。RepA, 阳性对照；U1和P4P6, 阴性对照；G, GST，对照；A, ATRX蛋白.

c. RNA-seq和RT-qPCR显示，切割TERRA后，端粒酶RNA元件Terc增加为2倍；pull down、RNA FISH证明TERRA与Terc体内结合。

d. 切割TERRA，TIF(telomere-induced DNA damage foci，端粒功能异常的时候就会出现)增加，证明TERRA调控端粒酶活性，维持端粒完整性。

至此，文章就完美地结束了，其中有很多实验技术咱们都可以参考看看能否解决自己研究lncRNA与蛋白互作时遇到的问题，比如ChIRP-seq、LNA GapmeR、iDRiP。这篇文章发掘了TERRA修复端粒以外的新功能——调控邻近的其他基因转录，还与很多蛋白结合，为TERRA的研究开辟了更多的道路。 

原文：Chu, et al. TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres.  Cell. 2017.06.017.

延伸阅读：ChIRP与CHART技术比较

相同点：

ChIRP与CHART都是研究RNA的技术，使用探针沉淀染色质，揭示lncRNA在基因组上的结合位点。操作方面，均是交联后用生物素（或链酶亲和素）反义探针捕获，用链霉亲和素磁珠回收，将沉淀的蛋白、RNA、DNA分别收集，后两者可以继续进行RT-PCR或高通量测序。ChIRP提取到的蛋白可以进行质谱分析。

不同点：

1. 探针的大小与设计不同。ChIRP能覆盖lncRNA序列的全长，靶向所有潜在的位点，探针序列较短（~20bp），易于合成，可以减少脱靶；而CHART通过RNaseH试验寻找合适的靶标位点，设计探针（18~28bp）。

2. 交联方法不同。ChIRP使用的是戊二醛，CHART使用的是甲醛，已证明较大的交联试剂（戊二醛）效率更高。

 

	优点	缺点
CHART	使用更少量的探针，减少背景信号	交联使用甲醛溶液，效率不高
	不需要已知特异结构域	探针合成需要经过RNaseH试验，耗费时间
ChIRP	揭示全基因组范围的lncRNA DNA结合位点	与dChIRP相比，信噪比较高
	需要已知特异结构域，探针覆盖lncRNA全长	不能揭示特异的lncRNA结构域
	探针短，合成方便，脱靶效应少