客户文章 │ J Exp Clin Cancer Res:研究发现CTC的新兴标志物和胃癌治疗靶点(IF=11.4)

2024-08-03

 

论文索引

题目】Exploring new frontiers: cell surface vimentin as an emerging marker for circulating tumor cells and a promising therapeutic target in advanced gastric Cancer

期刊】nature cell biology

发表时间】2024年4月30日

IF】11.4

单位/通讯作者】中国医科大学附属第一医院赵明芳/李贺明团队和上海中医药大学胥孜杭团队

关键词】胃癌;生物标志物;细胞表面波形蛋白;循环肿瘤细胞

 

2024年4月30日,中国医科大学附属第一医院赵明芳/李贺明团队和上海中医药大学胥孜杭团队联合在《Journal of Experimental &Clinical Cancer Research》发表题为“Exploring new frontiers: cell surface vimentin as an emerging marker for circulating tumor cells and a promi csing therapeutic target in advanced gastric Cancer”的研究论文。这项研究探讨了利用细胞表面波形蛋白(Cell surface vimentin,CSV)作为一种新型的循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells,CTCs)检测标志物在胃癌中的应用,研究结果揭示了CSV在预测晚期胃癌患者的治疗和预后方面的潜力,且证实了同时抑制CSV和IGF-IR信号通路具有抑制胃癌转移的潜力,提供了新的治疗靶点。

 

图1. 研究概述

 

研究思路

 

 

1. 基于CSV的CTCs检测平台,具有高灵敏度和特异性 

该研究为评估CSV在鉴定胃癌(Gastric cancer,GC)患者CTCs方面的敏感性,进行了使用CFSE(细胞增殖荧光探针)标记的BGC-823 GC细胞进行了血液峰值试验,结果表明抗体能够从外周血单核细胞中识别少量细胞,线性回归分析显示,刺突细胞数量与回收率呈正相关(p<0.05)。CSV+CTCs检测方法对GC样本具有高度敏感性。

 

为验证CTCs的肿瘤来源,该研究通过IHC、HE、对晚期GC患者样本进行WES(全外显子测序)的方法,研究结果表明CSV可作为GC患者CTCs检测新的生物标志物。

 

图2. 用CSV抗体检测外周血样本中的CTCs,通过血液峰值试验和WES进行验证

 

2. EpCAM与CSV分离方法所得数据的比较 

该研究使用CSV和EpCAM抗体方法对127例GC患者的血液样本进行了CTCs捕获,结果表明CSV 84-1抗体具有高特异性。

 

另外,与EpCAM方法相比,CSV方法在不可切除晚期GC患者中检测到更高水平的CTCs。

 

图3. A)CSV和EpCAM方法在可切除和不可切除GC患者中CTCs的阴阳性对比;B)CSV+CTCs计数与EpCAM+CTCs计数的比较

 

3. CSV+CTCs与晚期GC患者的治疗反应和预后不良相关 

该研究使用EpCAM+CTCs方法对66名晚期GC患者进行研究分析,结果发现CSV+CTCs阳性率与高PS评分、年龄大和治疗反应差显著相关,且CSV+CTCs计数高于EpCAM+CTCs计数。

 

比例分析显示,具有CSV/EpCAM比例(M/E)>1的患者大多数属于PD组。这表明CSV+CTCs在预测晚期GC患者治疗反应方面优于EpCAM+CTCs。

 

图4. C)Stable患者和PD患者CSV+CTCs计数与EpCAM+CTCs计数的比较;D)上皮(蓝色)和间质(红色)表型的CTCs计数

 

通过ROC(受试者工作特征)分析,结果表明CSV+CTCs与EpCAM+CTCs在早期可切除GC患者中均无法预测DFS(无病生存期。此外,Cox回归模型显示,CSV+CTCs与内脏转移和治疗策略的结合关联晚期GC患者的不良预后。

 

4. CSV法对GC合并PD患者的评估更敏感、更特异,其检测CTCs比影像评估更早预测治疗反应 

该研究通过热图分析、ROC等方法,结果发现CSV+EpCAM方法在预测疾病结果方面更优,但在评估PD患者和Stable患者时不如CSV法。

 

该研究分析了16名根据RECIST 1.1(实体瘤疗效评价标准)初步确认病情稳定的晚期GC患者的CTCs检测结果,也比较了使用不同CTCs检测方法预测PD时间与影像学预测的PD时间差异。结果证实CSV法进行CTCs富集可更早预测治疗反应。

 

5. CSV表达与GC的转移潜能相关 

该研究通过流式细胞术和IF法对不同GC细胞系进行一系列体外实验,GC细胞的迁移能力与CSV表达和EMT表型呈正相关。

 

进一步通过建立的肺转移小鼠模型进行研究评估,并注射BGC-823细胞。与用于CTCs富集和免疫荧光染色的84-1抗体不同,Pritumumab(普林木单抗是一种通过与CSV结合诱导胶质瘤细胞死亡的治疗性抗体)具有抗肿瘤潜力,并显著延长了肺转移模型小鼠的生存期。

 

流式细胞术分析进一步证实了Pritumumab组的CSV+CTCs数量显著减少。然而,CSV+GC细胞未在皮下异种移植瘤中检测到。这些结果表明,CSV表达与GC转移能力正相关,阻断CSV表达的普林木单抗可能成为治疗转移性GC的新药物干预手段。

  

6. m6A RNA去甲基化基因(FTO)调控晚期GC中CSV 

既往研究显示m6A RNA修饰在各种癌症的EMT(上皮间质转化)过程中起重要作用。该研究分析了300名晚期GC患者的m6A 甲基化模式,重点关注FTO和ALKBH5(去甲基化酶基因)。研究将患者分为两类:EraserCluster A(ALKBH5过表达)和EraserCluster B(FTO过表达),研究发现发现EraserCluster B与EMT过程、中晚期GC及预后不良显著相关。

 

又通过GO分析和GSVA分析,结果表明EraserCluster B与免疫抑制和癌症相关的生物过程有关,并显示出增强的基质活性。这些结果表明,FTO通过调控EMT过程,参与CSV表达和CSV+CTCs的形成。

 

 

图5. 300名GC患者队列的m6A甲基化模式

 

7. FTO通过调节CSV表达促进胃癌转移

该研究通过HGC-27细胞的FTO敲低实验,发现在HGC-27中敲低FTO或使用FB23-2(FTO特异性抑制剂)可显著降低GC细胞的转移和增殖能力。通过Transwell实验和细胞克隆形成,发现CSV的表达水平显著降低,进一步验证FTO对GC转移的影响。此外,在肺转移小鼠模型中,FB23-2表现出抗转移活性。

 

又通过体内研究,结果显示在皮下异种移植中缺乏CSV+GC细胞,而不像肺转移模型中明显存在,强调了CSV在通过血液促进癌症转移中的作用。

  

8. GC中FTO潜在靶基因的鉴定 

该研究通过m6A-seq和RNA-seq,确定了FTO在GC中的潜在靶基因。研究发现敲低FTO会导致基因组CDS和3'-UTR中m6A富集增加,但对5'-UTR影响较小。此外,在对照组和FTO敲低细胞中分别鉴定出3608个4930个m6A基因。GGAC motif在FTO敲低细胞中m6A位点高度富集。

 

进一步分析316个EMT相关基因、3405个m6A调控基因和1659个改变基因,其中IGF-IR被选作EMT的关键因子。对这些基因的GO分析也揭示了它们与细胞连接和EMT调控有潜关联。

 

该研究还通过MeRIP-qPCRSELECT-m6A试剂盒(Epibiotek)验证了IGF-IR mRNA的m6A修饰,结果抗m6A抗体显著富集了FTO敲低GC细胞中IGF-IR的mRNA水平,FTO去甲基化后,IGF-IR的m6A修饰CT值显著降低。此外,公共数据库分析结果显示,在泛癌中FTO表达水平较高,其与IGF-IR水平和不良预后呈正相关。

 

综上,这些结果表明IGF-IR是GC中FTO的潜在靶基因。

 

图6. A)FTO组与对照组的m6A修饰metagene图;B)对照组与si-FTP HGC-27细胞中m6A修饰基因的数量

 

 

图7. C)FTO敲低的HGC-27细胞中m6A富集鉴定的motif;D)对照组与si-FTO组mRNA转录本中m6A富集分布比例;E)FTO敲低后的m6A富集的转录本与差异表达基因重叠的韦恩图

 

 

图8. FTO敲低的HGC-27细胞中下调基因的生物过程类别中GO富集气泡图

 

9. YTHDF2介导的RNA衰变调节FTO靶基因的表达 

该研究调查了YTHDF家族成员如何通过m6A RNA修饰影响FTO在调节IGF-IR表达中的调控作用。研究发现敲低YTHDF1或YTHDF3对IGF-IR或IGF-I mRNA水平无影响。但在对照组中,敲低YTHDF2显著增加IGF-I和IGF-IR的mRNA表达,但在敲低FTO的GC细胞中逆转。敲低FTO降低了IGF-I和IGF-IR mRNA稳定性,反之敲低YTHDF2增加了FTO敲低的GC细胞中IGF-IR mRNA稳定性

  

10. 通过分子对接和分子动力学模型进一步确定IGF-IR为FTO的直接靶点 

该研究使用分子对接分析了配体-蛋白相互作用,结果显示当IGF-IR共晶化合物重新对接到IGF-IR活性位点时,RMSD值为1.168Å,表明分子对接方法的可靠性。

 

为了进一步确认IGF-IR和FB23-2复合物的稳定性和行为,进行了100 ns的分子动力学模拟,发现蛋白骨架和配体的RMSD曲线稳定,波动分别在2.6Å和2.9Å左右。

 

总的来说,复合物的稳定性、一致的结合模式以及在柔性环区域的波动支持FB23-2与IGF-IR形成稳定可靠的相互作用,表明其具有很强的结合亲和力。这些发现进一步支持了IGF-IR作为FTO直接靶基因的鉴定。

  

11. IGF-IR信号通路在调节CSV表达中的意义 

通过GSEA分析发现与IGF-I/IGF-IR信号通路相关的基因集中EMT进程的正向富集(NES=1.82;FDR=0.052)。

 

使用TMT定量蛋白质组学分析,结果显示IGF-I刺激组中33种与EMT相关的蛋白质表达水平显著增加。

GO富集分析表明,这些差异表达的蛋白质主要参与EMT、膜钙粘蛋白结合和生长因子结合。进一步分析识别出15条关键的IGF-I相关通路,这些通路表现出显著的富集。此外,通过PPIs分析,在IGF-I刺激组中发现7种蛋白质直接与IGF-IR信号通路相互作用。

 

总之,这些结果进一步支持了IGF-IR信号通路在EMT过程中的关键作用以及对CSV表达的调控作用。

 

图9. GSEA分析结果显示与IGF-I/IGF-IR信号通路相关的基因集在EMT过程

 

12. IGF-I诱导的波形蛋白磷酸化和易位增强了GC细胞中CSV的表达 

为研究IGF-IR信号通路在GC细胞中对CSV表达的调控机制,该研究使用流式细胞术、亚细胞定位的分析、磷酸化位点分析等试验,结果发现IGF-I诱导的CSV通过波形蛋白磷酸化从细胞质转移到细胞表面,IGF-IR信号通路的激活可能通过促进CSV的转移上调GC细胞中的CSV表达

 

13. 抑制CSV与IGF-IR抑制剂联合使用可抑制裸鼠CSV+CTCs的形成与转移 

最后,该研究探讨了普林木单抗和GSK1838705A(一种有效且可逆的IGF-IR和胰岛素受体抑制剂)联合治疗对肺转移小鼠模型中CSV表达和GC转移的影响。通过体内实验、IHC、WB等试验,研究结果发现普林木单抗和GSK1838705A均表现出显著的抗肿瘤效果,但联合治疗效果更显著。普林木单抗、GSK1838705A及其联合治疗组中,CSV+CTCs数量显著减少。

 

IHC结果显示,肺肿瘤组织中E-钙粘蛋白表达增加,而CSV和FN1表达减少,表明EMT过程受到抑制。

IHC和WB分析结果显示,普林木单抗、GSK1838705A及其联合治疗组中p-AKT和NF-κB表达显著抑制。

 

总之,这些结果表明联合使用普林木单抗和GSK1838705A不仅抑制了CSV表达,还通过抑制EMT和IGF-I信号通路,显著延长了肺转移小鼠的生存时间。

 

讨 论

这篇研究文章进行了一项前瞻性研究,比较了使用EpCAM和CSV特异性抗体84-1检测GC患者CTCs的差异。CSV特异性抗体84-1是一种验证过的通用标志物,可用于识别各种肿瘤类型中的EMT-CTCs。研究发现,CSV+CTCs方法能够更准确地评估晚期GC患者的治疗效果和预后;FTO是CSV+CTCs形成和转移的关键调节因子,通过抑制IGF-IR mRNA的降解并促进CSV从细胞质向细胞表面的转移来发挥作用;实施CSV+CTC检测方法为评估复发风险和制定个性化治疗方案提供了新的视角。

总之,这项研究建议使用CSV和EpCAM标志物进行CTCs富集,且强调了Pritumumab(普林木单抗)在抑制GC转移中的作用,表明CSV不仅是CTCs的标志物,也是晚期GC的治疗靶点。

 

参考文献:

Li H, Zhu YZ, Xu L, et al. Exploring new frontiers: cell surface vimentin as an emerging marker for circulating tumor cells and a promising therapeutic target in advanced gastric Cancer. J Exp Clin Cancer Res. 2024;43(1):129. Published 2024 Apr 30.

 

m6A、m5C、m1A、m7G、ac4C、m6Am、假尿嘧啶修饰测序服务

表观生物拥有多种RNA修饰测序服务,包括meRIP-seqmRNA m5C BS-seq、m1A-seq、TRAC-seqacRIP-seqPA-ψ-seqm6Am-seqONT Direct RNA全长转录组测技术等(点击各技术名称可了解更多),为研究者绘制全转录组RNA修饰图谱;表观生物还提供SELECT-m6A qPCR检测方法,填补市场上特定位点m6A常规检测技术的空白,可应用于鉴定m6A相关蛋白的作用靶点,深入挖掘m6A修饰的作用机制以上技术与我司Ribo-seqPolysome-seqSLAM-seq技术结合,构建完备的RNA修饰研究解决方案;还可与CUT&TagHiChIP等表观基因组学进行创新组合,打破组学壁垒,冲刺高分文章!

- - - 推荐阅读 - - -