环状RNA翻译蛋白质鉴定与功能机制研究
1.立项依据
1.1研究背景
随着生命科学的发展，目前科学家们已经从DNA、mRNA、miRNA和蛋白质等分子水平对许多疾病有了深入的研究，但病理机制仍不完全明白，尤其是癌症疾病仍为医学难题。而环状RNA（circRNAs）在疾病中的作用逐渐被科学家们发现并且它们在疾病发展中都有调控作用[1]，关于circRNAs编码多肽的功能也逐渐被研究报道[2,3]。
circRNAs 是一类不具帽子和尾巴并以共价键形成环形结构的RNA 分子，它不受RNA外切酶影响，表达稳定不易降解。目前已知的环状 RNA 可分为外显子环状 RNA，内含子环状RNA和外显子-内含子环状RNA，后者环状RNA是一种既包含了外显子又含有一段内含子序列的环状RNA。它可以多种方式发挥功能：可作为“海绵”吸附microRNA，防止microRNA与mRNA相互作用，间接调控microRNA下游靶基因的表达；通过与mRNA结合蛋白结合，进而改变mRNA剪接模式；可与RNA聚合酶Ⅱ结合影响转录进程。研究发现大量circRNAs参与疾病调节，如环状RNA hsa_circ_0005105，它可参与调节骨关节炎的病理过程[4]、circ_Amotl1可参与乳腺癌的发病过程[5]、 RNAhas_circ_0067934可促进食管鳞状细胞癌细胞增殖[6]和circPVT1促进胃癌细胞增殖等[7]。
然而随着技术的发展，特别是核糖体分析和质谱（MS）蛋白质组学的发展，人们发现了许多具有编码潜力的circRNAs[8,9]，如circ-FBXW7、circ-SHPRH和circPINTexon2，他们可编码成多肽并且具有抑制胶质瘤细胞的功能[10,11,12]。然而关于circRNA编码多肽在癌症等疾病中的探究相对较少，因此circRNA编码多肽的探究有望为癌症等疾病发生发展机制的探究从新角度提供有力参考。
1.2研究意义
本研究方案从癌症细胞中测序得到差异表达的circRNAs并从中分析出具有编码潜能的RNA，经实验验证可从中发现对疾病发生发展具有明显作用的circRNAs来源的多肽并对其作用机制进行深入的探讨。已被报道的circRNAs在疾病中所发挥的作用可能源于其所编码的多肽，这将从新的角度对疾病及癌症的研究提供理论依据。
2.研究目标
本研究目标旨在发现新的具备编码能力的circRNA,并解析其在疾病中的生物学功能，为将来的医疗提供新型的标志物或潜在的药物靶标。
3.研究内容
内容一、处理组和对照组细胞整体翻译水平变化研究；
内容二、鉴定显著差异翻译效率的基因；
内容三、鉴定肿瘤特异性多肽；
内容四、肿瘤密码子使用图谱；
内容五、鉴定肿瘤特异的新生抗原；
内容六、实验验证及功能机制探究。
4.创新点和拟解决的关键科学问题
4.1创新点
癌症致死率高，发病机制难以探究一直是困扰科学家的难题。本研究方案以Ribo-seq和longRNA-seq技术手段联合分析从circRNA翻译多肽的角度探究癌症的发生发展过程。本项目拟通过发现新生肽，试图为探究癌症的发生发展机制提供新的理论依据,并为临床检测和治疗提供参考。
4.2拟解决的关键科学问题
问题一、病人病灶组织中是否有表达异常的circRNA？
问题二、异常表达的circRNA中是否有可编码多肽的RNA？
问题三、circRNA编码的新生多肽是怎样影响疾病发生发展？
问题四、这些可调控疾病进程的新生多肽是否能作为临床诊断和治疗的参考？
5.研究方法及技术路径
5.1研究方法
• 送样要求
（1）样本类型：活细胞样本，细胞数量≥ 1×107
（2）样本物种：仅限人、大小鼠，其他物种需评估
• 样品分组
（1）常规要求至少 2 组样品，包括对照组和实验组（临床样本为正常人组和患者组）
（2）每个样品均进行 Ribo-seq 和 lncRNA-seq（采用去 rRNA 建库法）
（3）样本数建议：3 VS 3
图1. Ribo-seq建库流程图
永顺
图2.Ribo-seq和longRNA-seq测序分析流程图
5.2技术路径
6关键技术
6.1 技术原理
Ribo-seq测序原理：
利用低浓度 RNase 处理核糖体-新生肽链复合物，降解没有核糖体覆盖的 mRNA 片段，随后再去除核糖体，通过二代测序技术检测被核糖体保护的约 22-30 bp 的 RNA 小片段（称为 ribosome footprints，RFPs；又称 ribosome protected fragments，RPFs），可得到核糖体分布的位置信息，据此可得到每种转录本上核糖体的分布、密度，可推测起始密码子位置（包括非 ATG 起始）、ORF（开放阅读框）位置、翻译暂停区域以及 uORFs （上游开放阅读框）等信息。
LongRNA-seq测序原理：
LongRNA-seq是一种全面检测细胞和组织长片段RNA（>200nt）的转录组测序方法,包括线性的mRNA和lncRNA分子以及circRNA，可准确高效揭示转录组的表达全貌，是非编码RNA的重要研究技术。它是将样品进行提取RNA后建库测序，然后对原始数据进行质控并去除rRNA。将质控后的数据比对到参考基因组，得到比对成功和比对不成功的两组序列。将比对成功的序列进行注释并定量分析得到mRNA和lncRNA，将比对不成功的序列反向拼接之后比对参考基因组，比对上参考基因组的及为circRNA。
6.2 分析内容
图3.测序及生物信息分析内容
参考文献
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[10]Chen He,Liu Ying,Li Peiling,Zhu Daling. RE: Novel Role of FBXW7 Circular RNA in Repressing Glioma Tumorigenesis.[J]. Journal of the National Cancer Institute,2018.
[11]Zhang Maolei,Huang Nunu,Yang Xuesong,Luo Jingyan,Yan Sheng,Xiao Feizhe,Chen Wenping,Gao Xinya,Zhao Kun,Zhou Huangkai,Li Ziqiang,Ming Liu,Xie Bo,Zhang Nu. A novel protein encoded by the circular form of the SHPRH gene suppresses glioma tumorigenesis.[J]. Oncogene,2018,37(13).
[12]Zhang Maolei,Zhao Kun,Xu Xiaoping,Yang Yibing,Yan Sheng,Wei Ping,Liu Hui,Xu Jianbo,Xiao Feizhe,Zhou Huangkai,Yang Xuesong,Huang Nunu,Liu Jinglei,He Kejun,Xie Keping,Zhang Gong,Huang Suyun,Zhang Nu. A peptide encoded by circular form of LINC-PINT suppresses oncogenic transcriptional elongation in glioblastoma.[J]. Nature communications,2018,9(1).
