1.立项依据

lncRNAs分子,它是一组长度超过200个核苷酸的RNA转录物，lncRNAs可分为5类：正义 lncRNA、反义 lncRNA、基因间lncRNA、基因内lncRNA和双向 lncRNA[4]。可通过调节染色质重构，DNA修饰，组蛋白及蛋白质修饰等多种方式发挥功能[1]。由于lncRNAs缺乏长的或保守的开放阅读框（ORF），多年来被认为不可编码蛋白质但可广泛参与机体的生理和病理活动[5,3]。有研究报道，TGFB2-OT1 作为lncRNA来吸附miRNA进而诱导下游基因表达变化影响炎症反应[2]。另外还有大量研究发现lncRNA可参与机体炎症反应，如炎症性肠炎[6]、变应性鼻炎[7]和病原菌诱导的急慢性炎症反应等[8]。除在炎症放面的研究报道外，lncRNAs还参与了癌症等疾病的发生发展过程，如HOTAIR可促进癌细胞增殖和间质样转化[9]；H19在乳腺癌细胞增殖中起着重要的作用[10]以及LSINCT5[11]、LincRNA-ROR[12]和MEG3[13]等lncRNA参与了多种癌症的发展过程。

在已有报道中lncRNA最多作用方式为lncRNA结合microRNA，从而防止microRNA靶基因的降解；lncRNA结合蛋白直接抑制蛋白发挥作用；lncRNA结合DNA调控基因表达；作为分子伴侣，结合蛋白质并将其定位到DNA序列上进而调控表达。然而随着技术的发展，特别是核糖体分析和质谱（MS）蛋白质组学的发展，人们发现了许多具有编码潜力的IncRNAs[14,15,16]。lncRNAs编码的多肽功能也逐渐被研究报道，如SPAR，一种LINC00961编码肽，它在人类和小鼠中长度不相同但可调节mTORC1的活性并抑制肌肉再生[17]；lncRNA HOXB-AS3，能够抑制结肠癌细胞的生长、克隆形成和侵袭转移[18]。作为一类新的细胞调节因子在关键的致癌通路中仍待进一步揭示，因此从lncRNAs编码多肽的角度探究疾病发生可为临床诊断和治疗提供依据。

1.2研究意义

在人类和小鼠中发挥重要生物学功能的LncRNA编码的微蛋白通常在物种间保守[19,20,17]，但此方面的研究报道较少。本研究方案从癌症细胞中测序得到差异表达的lncRNAs并从中分析出具有编码潜能的RNA，经实验验证可从中发现对疾病发生发展具有明显作用的lncRNAs来源的短肽并对其作用机制进行深入的探讨。已被报道的lncRNAs在疾病中所发挥的作用可能源于其所编码的短肽。这将从新的角度对疾病及癌症的研究提供理论依据。

2.研究目标

本研究目标旨在发现新的具备编码能力的lncRNA,并解析其在疾病中的生物学功能，为将来的医疗提供新型的标志物或潜在的药物靶标。

3.研究内容

内容一、处理组和对照组细胞整体翻译水平变化研究；

内容二、鉴定显著差异翻译效率的基因；

内容三、鉴定肿瘤特异性短肽；

内容四、肿瘤密码子使用图谱；

内容五、鉴定肿瘤特异的新生抗原；

内容六、实验验证及功能机制探究。

4.创新点和拟解决的关键科学问题

4.1创新点       

本研究方案以Ribo-seq和longRNA-seq技术手段联合分析从lncRNA翻译短肽的角度探究癌症的发生发展过程。目前关于非编码RNA的研究主要集中在其作为核酸链发挥作用的阶段，对其编码短肽的潜能关注较少。本项目拟通过发现新生肽，试图为探究癌症的发生发展机制提供新的理论依据,并为临床检测和治疗提供参考。

4.2拟解决的关键科学问题

问题一、病人病灶组织中是否有表达异常的lncRNA？

问题二、异常表达的lncRNA中是否有可编码短肽的RNA？

问题三、lncRNA编码的新生短肽是怎样影响疾病发生发展？

问题四、这些可调控疾病进程的新生短肽是否能作为临床诊断和治疗的参考？

5.研究方法及技术路径

5.1研究方法

5.1.1实验样本

• 送样要求

（1）样本类型：活细胞样本，细胞数量≥ 1×10⁷

（2）样本物种：仅限人、大小鼠，其他物种需评估

• 样品分组

（1）常规要求至少 2 组样品，包括对照组和实验组（临床样本为正常人组和患者组）

（2）每个样品均进行 Ribo-seq 和 lncRNA-seq（采用去 rRNA 建库法）

（3）样本数建议：3 VS 3

5.1.2建库及高通量测序

图1. Ribo-seq建库流程图

永顺
 

图2.Ribo-seq和longRNA-seq测序分析流程图

5.2技术路径

图3.lncRNA翻译短肽研究路径

6关键技术 

6.1 技术原理

Ribo-seq测序原理：

利用低浓度 RNase 处理核糖体-新生肽链复合物，降解没有核糖体覆盖的 mRNA 片段，随后再去除核糖体，通过二代测序技术检测被核糖体保护的约 22-30 bp 的 RNA 小片段（称为 ribosome footprints，RFPs；又称 ribosome protected fragments，RPFs），可得到核糖体分布的位置信息，据此可得到每种转录本上核糖体的分布、密度，可推测起始密码子位置（包括非 ATG 起始）、ORF（开放阅读框）位置、翻译暂停区域以及 uORFs （上游开放阅读框）等信息。

LongRNA-seq测序原理：

LongRNA-seq是一种全面检测细胞和组织长片段RNA（>200nt）的转录组测序方法,包括线性的mRNA和lncRNA分子以及circRNA，可准确高效揭示转录组的表达全貌，是非编码RNA的重要研究技术。它是将样品进行提取RNA后建库测序，然后对原始数据进行质控并去除rRNA。将质控后的数据比对到参考基因组，得到比对成功和比对不成功的两组序列。将比对成功的序列进行注释并定量分析得到mRNA和lncRNA，将比对不成功的序列反向拼接之后比对参考基因组，比对上参考基因组的及为circRNA.

6.2 分析内容

图3.测序及生物信息分析内容

参考文献

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