当 RNA 咬住了自己的尾巴，变身环形 RNA（circular RNA，以下简称 circRNA）之后，会有怎样特殊的功能呢？跟随小编的步伐，简单回顾 circRNA 的研究历程，接着深入剖析 8 月 10 日在 Science 上 online 的一篇关于 circRNA 的文章，了解 circRNA 的功能和研究范式，最后对今后可能的方向进行展望。

这篇 Science 首先在小鼠和人脑组织切片中验证了 miR-7 和 miR-671 可按照不同的方式结合 circRNA Cdr1as，接着通过 CRISPR/Cas9 技术敲除 Cdr1as 的一个基因座制造杂合突变小鼠，选取 4 个脑区进行分析，发现 miR-7 显著下调，miR-671 显著上调，此外 miR-7 的靶基因显著上调；这些基因表达异常可影响兴奋性突触传递过程，进而导致小鼠前脉冲抑制（PPI）障碍。PPI 在精神分裂症等多种神经精神性疾病中丧失，提示 circRNA Cdr1as 在这些疾病中的潜在功能。

 

如果 RNA 也像蛇一样咬住自己的尾巴

1864 年，德国青年化学家凯库勒研究苯环的结构已经三年，依然没有突破。寒冬中的一天晚上，凯库勒坐在桌前写教科书，写的有些累了，他把椅子转向炉火，打起瞌睡。在梦中，原子在凯库勒眼前跳跃，大的、小的、成串的。突然成串的原子旋转起来，像蛇一样咬住自己的尾巴！看！有一条蛇咬住了自己的尾巴，这个形状在眼前旋转不停。电光一闪，凯库勒从梦中惊醒。苯的结构为什么不能是环状的呢！1865 年，凯库勒发表了苯的六元环结构，这是有机化学中里程碑式的发现。

 

图 1. 凯库勒美妙的梦揭开了有机化学的新篇章

 

中心法则中，遗传信息从 DNA 流向 RNA，接着流向蛋白质。RNA 似乎只是一个遗传信息的“快递员”，但越来越多的研究发现 RNA 的功能异常丰富，远不止“快递员”这么简单，尤其是大量非编码 RNA（noncodingRNA, ncRNA）。但我们所熟知的 ncRNA，比如 miRNA、siRNA、lncRNA、piRNA 等，在印象中都是线性的。是否也存在可以咬住自己尾巴的环形 RNA 呢？

确实存在，而且存在了很多年。早在 1976 年的时候，科学家们就已经发现了 CircRNA，但当时误以为是类病毒；1979 年，才搞清楚这是内源性 RNA 剪接的产物；此后的几十年，人们一直认为 CircRNA 是可变剪接出错的结果，没有给予太多重视。直到近 5 年，CircRNA 才逐渐火热起来！

 

图 2. 以 CircRNA 为关键词在 Pubmed 中搜索的结果

（1976 年和 79 年的文章中用的都是 circular RNA，不是 circRNA，因此没有出现在统计中，数据统计日期为 2017 年 8 月 14 日）

 

仔细扒一扒 CircRNA 发展历程中的关键成果，发现 2012 年的一篇文章《Transcriptome-wide discovery of circular RNAs in Archaea》可谓“星星之火”，文章借助高通量测序技术，对古细菌中的 CircRNA 进行了全基因组范围的探究。

 

2013 年出现了六篇重要文章。其中包括三月份的两篇重量级 Nature 文章：Memczak 等揭示了 CircRNA 具有调控潜能；而 Hansen 等直接给出答案，CircRNA 可以作为 miRNA 海绵。随后的几个月，有文章系统性地分析了 CircRNA 在阿尔兹海默症以及癌症中的关键功能，这让 CircRNA 大显神通！很快有团队建立了 CircRNA 与疾病相关的数据库 Circ2Traits。之后 CircRNA 的研究呈指数增长，目前还在飞速发展中。 

 

图 3. CircRNA 研究历程中关键的文章

 

值得一提的是，中科院上海计算生物所的杨力研究员和生化细胞所的陈玲玲研究员（还是令人羡慕的夫妻）对 CircRNA 领域贡献颇丰。2014 年，杨力和陈玲玲老师开发了 CIRCexplorer，在人源胚胎干细胞 H9 中发现近万条 circRNA，首次证明了内含子 RNA 互补序列介导的外显子环化。近几年，陈玲玲老师和杨力老师持续发力，贡献了诸多重要的成果。

 

目前通常认为，CircRNA 是一类单链的环形 RNA，由 pre-mRNA 反向剪接（back-splicing）形成，通常含有 1~5 个外显子，可归入长链非编码 RNA 之列。CircRNA 的功能主要包括：(1) 可作为 miRNA 海绵，即一个 CircRNA 上具有很多个 miRNA 结合位点；(2) 可调控转录过程；(3) CircRNA 合成过程可影响可变剪接。此外，有研究报道 CricRNA 可影响 mRNA 的稳定性，甚至可翻译为蛋白发挥功能。

Cdr1as：在哺乳动物神经元中特异性表达

 

miRNA 可靶向与其互补的 mRNA，并在 Ago2 蛋白的作用下，对 mRNA 进行剪切。Ago2 介导的 mRNA 沉默过程会产生 miRNA-target RNA-Ago2 的嵌合体。通过 CLIP-Seq 技术，在小鼠和人类死亡的大脑中鉴定了上万个嵌合体。对 miR-7 嵌合体中的靶序列进行分析和排序，发现无论是在人类还是小鼠大脑中，排在第一位的都是 Cdr1as。

 

图 4. 在小鼠和人类脑组织中 miR-7 和 miR-671 可结合 Cdr1as

 

能与 Cdr1as 结合的还有 miR-671。但 miR-7 和 miR-671 跟 Cdr1as 的结合方式差异很大：首先，Cdr1as 有 70 个 miR-7 结合位点，而只有一个很强的 miR-671 结合位点；此外，miR-7 只有 5’-端的部分序列（seed，即种子序列）与 Cdr1as 互补配对，但 miR-671 几乎可以完美地与 Cdr1as 配对。这种结合方式的不同导致 miR-7 引导的 Ago2 蛋白不能对 Cdr1as 实现有效剪切，而 miR-671 却可以；miR-7 和 miR-671 结合 Cdr1as 的方式在物种中保守，提示这种特异性的结合方式可以具有关键的功能。

 

现在通常认为 Cdr1as 是 miR-7 的海绵，而 miR-671 介导的 Cdr1as 的降解可释放与 Cdr1as 结合的 miR-7。打一个比方，Cdr1as 就是一个带锁的小盒子，miR-7 和 miR-671 都是钥匙，Cdr1as 小盒子中可以存放 70 把 miR-7 的小钥匙，而只需要一把 miR-671 的钥匙，就可以打开 Cdr1as 这个盒子，进而释放 70 把钥匙，这 70 把钥匙又可以去打开其他过程的盒子。

 

值得注意的是，小鼠大脑中的嵌合体数据分析显示，与 miR-7 结合的 RNA 中排在第二位的是 lncRNA Cyrano。Cyrano 中包含一个几乎可以完美地与 miR-7 的结合位点，并且该位点高度保守，这也提示 lncRNA Cyrano 在中枢神经系统中对 miR-7 具有重要的调控作用。

 

那么 Cdr1as 在大脑中的表达模式是怎样的呢？这里用到了 RNA-FISH（荧光原位杂交），对不同的神经细胞用不同的荧光标签进行区分，发现在皮质切片中 Cdr1as 只在神经元中高表达，而且主要集中在兴奋性神经元中；而在神经胶质细胞（少突胶质细胞和星形胶质细胞）中不表达。

 

图 5. Cdr1as 在兴奋性神经元中高表达

(分子标签：NeuN-neurons, GFAP - astrocytes, Olig2 – oligodendrocytes, vGluT1 - excitatory neurons, GAD67 - inhibitoryneurons，每种神经元颜色见上图中字体颜色)

 

在不同的脑区中，比如前额皮质、海马、中脑和后脑，表达 Cdr1as 的绝大多数神经元都是 vGluT1 和 vGluT2 阳性的；在小脑中，Cdr1as 也只在含有大量兴奋性神经元的颗粒层中表达，而不在分子层中的 GABA能神经元（GABAergic neurons）和浦肯野细胞中表达。

 

图 6. 在不同脑区中 Cdr1s 的表达情况

 

进一步利用单分子 RNA FISH，在原代皮层神经元中发现 Cdr1as 不仅出现在神经元胞体中，还出现在突起（neurites）中，这说明在不同的亚细胞定位中，Cdr1as 都会有潜在的生物功能。

 

图 7. Cdr1as 可同时在胞体和突起中表达

 

基因编辑小鼠揭示 Cdr1as 功能

 

如何研究一个 CircRNA 的功能呢？在人类和小鼠大脑中，Cdr1as 可有效地环化，检测不到线性的转录本。CircRNA 非常稳定，半衰期很长，在转录水平上实现沉默有一定难度。最直接的策略是用 CRISPR/Ca9 敲除 Cdr1as 的基因座，制造功能缺失的小鼠模型。

 

但这种策略可能会影响另一条链的转录，让情况变得更加复杂。为了评估另一条链的表达情况，作者利用可以与 Cdr1 mRNA 互补的探针对小鼠的 4 个脑区进行检测，进行原位杂交实验，分析已经发表的 RNA-seq、CAGE 和染色质修饰数据。在小鼠的大脑、特定的脑区或者其他小鼠和人类组织中，都没有检测到 Cdr1as 反向互补链的转录。这说明用 CRISPR/Ca9 敲除 Cdr1as 的基因座是可行的。

图 8. 在小鼠小脑中可以检测到 Cdr1as，但检测不到 Cdr1mRNA

 

利用 CRISPR/Cas9 敲除 Cdr1as 基因座，并分别通过基因型、原位杂交、Northern blot 和 qRT-PCR 验证。

图 9. 验证 KO 小鼠

 

Cdr1as 位于 X 染色体上，因此在分析敲除的小鼠之前，需要先搞清楚在野生型（WT）雄性和雌性、以及杂合子雌性小鼠大脑中 Cdr1as 的表达情况。qRT-PCR 实验结果显示， Cdr1as 在野生型雄性和雌性小鼠中几乎一样，而杂合子雌性小鼠中 Cdr1as 的水平降低到 WT 的一半。

图 10. Cdr1as 在 WT 雄性和雌性以及杂合子中的表达

FB -forebrain(前脑), OB - olfactory bulb(嗅球), CB – cerebellum(小脑), BS – brainstem(脑干).

 

鉴于 WT 小鼠中，Cdr1as 表达与性别无关。后续的实验选用杂合子雄鼠做实验。

 

miR-1 和 miR-671 的转录后调控

 

之前在细胞系中，已经发现 miR-1 和 miR-671 可结合到 Cdr1as。但是在脑中是否也是这样呢？本文选取了高表达 Cdr1as 的小脑、皮质、海马和嗅球等 4 个主要脑区进行 miRNA seq。比较 WT 和 KO 小鼠 4 个脑区中的 miRNAseq 数据，并结合 Northern blot，发现 miR-7 在 KO 小鼠中显著下调。更加具体的情况是，miR-7a-5p 和 miR-7b-5p（它们的种子序列相同，成熟的 RNA 序列略有差别）在所有的脑区中均下调。

 

图 11. Cdr1as 敲除后在小鼠各脑区中差异性表达的 miRNA

 

miR-7 的表达下调具有高度特异性。在鉴定到的上百个 miRNAs 中，除了 miR-7a-5p 和 miR-7b-5p，另外只有 8 个 miRNA 显著下调，而且这只出现在皮质中。所有的这些 miRNA 属于两个家族，来源于三个原始转录本（miR-200c/141、miR-200a/200b/429、miR-182/183/96）。

 

miR-7 的表达下调是转录后（post-transcriptional）的。区分转录后和共转录（co-transcriptional）过程是分子生物学非常重要和本质的问题。测序结果显示，miR-7 的全部的三种中间链（passenger strands，分别为 miR-7a-1-3p、miR-7a-2-3p、miR-7b-3p）并没有显著下调（在上图中并不显著）。通过 Northern blot 和 pre-miR-7a-1 的 qRT-PCR 进行验证。另外，皮质中 miR-200 和 miR-183 家族来源的 miRNA 表达下调，可能是由于其中间链本身就下调了。

 

与 miR-7 相反，在 KO 动物的小脑、皮质和嗅球中，miR-671-5p 表达上调。跟 miR-7 类似，KO 小鼠中这种上调也是高度特异性的，而且除了 miR-671，没有发现其他显著上调的 miRNA。此外，miR-671-5p 的表达上调也是转录后的。在 KO 小鼠和野生型小鼠提取出的 RNA 中用 Northern blot 检测，虽然 miR-671-3p 可以检测到而且没有发生改变，但却没有检测到成熟的 miR-671-5p。为何 miR-671-5p 及其前体 RNA 这么难检测到呢？一是成熟的 miR-671 表达量很低，而且在实验中不稳定；二是前体 RNA 加工自 Chpf2 转录本的编码序列中。

 

此外，在非脑组织中分析 Cdr1as、miR-7、miR-671 的表达，包括肺、骨骼肌、脾脏、心脏、脊髓。在脾脏中，Cdr1as 检测不到，但是 miR-7a 稳定表达，其他组织显示出非常低的 Cdr1as 表达量，而 miR-7a 的表达在 Cdr1as 去除后并没有改变。miR-7 表达唯一发生改变的非脑组织是脊髓，这也是唯一可以检测到 Cdr1as 表达的非脑组织。

 

图 12. 在非脑组织中检测 Cdr1as、miR-1、miR-671 的表达

 

这些数据说明，在非脑组织中 Cdr1as 的缺失并不影响 miR-1 和 miR-671 的表达；而在神经组织中，miR-7 的下调则依赖于 Cdr1as 的缺失。

 

潜在媒介浮出水面：即早基因（immediate early genes）

何为即早基因（immediate early genes）呢？维基百科的解释是：Immediate early genes (IEGs) are genes which are activated transiently and rapidly in response to a wide variety of cellular stimuli.

 

miRNA 通过调控其靶基因进而影响个体的表型，这应该说是比较常规的套路了。在上面 4 个脑区中检测 miRNA 的同时做 mRNA-seq。在皮质、小脑和嗅球中，一些保守的 miR-7 靶基因显著上调，包括Fos、Nr4a3、Irs2、Klf4。此外，可与 miR-7 相互作用的lncRNA Cyrano 在 KO 小鼠的 4 个脑区中都高表达。

 

图 13. 在 Cdr1as 敲除后小鼠 4 个脑区中差异表达的基因

 

进一步对这些上调的基因进行审查，发现了一些显著的IEGs，比如 Fos、Arc、Egr1、Egr2、Nr4a3 等。用同一只动物和另外的动物中的皮质和海马，通过 qRT-PCR 和 Nanostring 进行验证，确认了所有的候选基因中，即早基因的蛋白表达水平升高。其中 c-Fos、Egr1、Arc 等通过 Western Blot 检测，进一步通过免疫组织化学验证 c-Fos 和 Egr1 在大脑切片中的表达。在四个脑区中对 c-Fos 的免疫组化结构进行定量，发现在 KO 小鼠中，表达 c-Fos 的神经元的数量增多，而且 c-Fos 信号强度更强。

 

图 14. 对 IEGs 等多重验证

 

miR-7 是细胞周期和 IEGs（比如 Fos）的抑制因子，提示了 Cdr1as 的去除与 IEGs 表达上调间的联系；第二，此前研究表明，IEGs 的表达上调与神经元的活性增加密切相关，因此暗示了 Cdr1as 导致的 IEGs 的上调可能会影响动物的行为。

 

在 KO 小鼠的非脑组织中，IEGs 的表达水平没有改变，说明 IEGs 表达上调是大脑依赖的，而且与 Cdr1as 的水平密切相关。除了 IEGs，在 KO 小鼠大脑中，还发现了一些差异表达的生物钟基因，比如 Per1 和 Sik1相应地上调，而 Dbp 相应地下调。此前研究发现，在前脑中，这种表达的模式与睡眠剥夺与持续性觉醒相关。

 

Cdr1as 与兴奋性突触传递失调

 

Cdr1as 缺失后，在突触水平到底会产生什么生理学结果呢？利用单海马神经元研究兴奋性突触后电流（excitatory post synaptic currents，EPSCs）。结果发现，在 KO 小鼠的神经元中，自发性的囊泡释放显著上调，微小兴奋性突触后电流频率（而不是振幅）加倍。通过分析钙离子诱发的突触反应，发现 KO 与 WT 小鼠神经元相比，兴奋性突触后电流的振幅并没有显著不同。

 

虽然计算得到的囊泡释放概论没有发生显著改变，但是 KO 小鼠对两个连续刺激的响应，以及对 10Hz 的动作电位序列的响应与 WT 小鼠显著不同。

 

这些结果反应了在 KO 小鼠神经元正在进行的突触释放活动中囊泡置换活性发生改变，以及在突触响应中显示出更强的抑制作用。总的来说，Cdr1as 的缺乏可导致兴奋性突触传递的失调，潜在的机制包括突触蛋白表达的变化、突触特化异常、突触钙稳态的改变。

 

小鼠行为上有什么具体体现呢？分别对 WT 小鼠和 KO 小鼠进行行为学实验。KO 小鼠的社会活动、焦虑水平、不受干扰的自发活动、在认知记忆或探索行为方面都没有显著的缺陷，但是唯独惊吓反应测试中，在三个不同的前脉冲强度下，前脉冲抑制（prepulse inhibition，PPI）显示出很强的差异。

 

PPI 指惊吓反射中在惊吓刺激（脉冲)之前给予轻微刺激(前脉冲)可以抑制动物对刺激反应的现象。PPI 是感觉运动门控水平的标志之一。精神分裂症患者感觉运动门控丧失，从而导致信息超载出现幻觉和妄想症状，同时伴有 PPI 的降低，PPI 是认知障碍的可测量的指标之一。（本段解释来自于《认知障碍的前脉冲抑制模型》）

 

图 15. Cdr1as 的敲除显著影响小鼠的 PPI

 

总的来说，Cdr1as 的敲除显示出与神经精神疾病相关的表型，比如 PPI 受损，而且IEGs 很有可能参与其中。这些结果为今后的研究提供了很好的参考价值，也提供了很多可供挖掘的线索。

讨论：

1. 为何这篇文章可以发在Science？

第一，这篇文章建立了 CircRNA 与神经精神性疾病间的联系；第二，本文做的是热点领域 CircRNA，而且阐明了一种特定的 CircRNA Cdr1as 在哺乳动物脑中的功能；第三，本文提供了很多后续研究的线索；第四，本文内容详实，大量的炫酷的荧光图应该也是一个加分项。

 

2. 本文用到了 CRISPR/Cas9 技术，其脱靶效应如何解决？

文章也提到了这一点，但是作者无法排除这一点。

3. 文章到底提供了哪些可以后续研究的线索？

(1) 文章附表中给出了与 miR-7 结合排在前 10 的 RNA，本文研究的只是排在第一的Cdr1as，而且提到了排在第二的 lncRNA Cyrano 也可能具有很重要的作用，因此 Cyrano 到底在哺乳动物大脑中发挥什么功能呢？这绝对是非常有潜力的一个点。

(2) KO 小鼠中，一批 IEGs 上调，这些 IEGs 上调与小鼠的 PPI 抑制表型之间到底有什么关系？哪几个 IEGs 起到关键作用？具体的通路又是怎样的？

(3) KO小鼠大脑中，miR-7 表达下调后，不仅仅是 IEGs 受到影响，还有很多非 IEGs 的基因也差异性表达，那么这些基因的差异性表达又会产生哪些影响呢？

(4) miR-7、miR-671、miR-200 家族等都与肿瘤密切相关，Cdr1as 如何通过这些 miRNA 介导肿瘤的发生发展，这也是一个具有前景的方向。

通讯作者：从物理学家到生物学家

本文通讯作者为柏林医学系统生物学研究所的 Nikolaus Rajewsky。

图 16. 本文通讯作者 Nikolaus Rajewsky

 

Nikolaus Rajewsky 于 1997 年获得德国科隆大学（University of Cologne）理论物理博士学位，随后在美国罗格斯大学（Rutgers University）从事计算物理学博士后研究，第二轮博后他去了洛克菲勒大学的物理与生物学研究中心；2003 年获得纽约大学教职，任生物学和数学助理教授。2006 年，他回到德国，出任马克斯 • 德尔布吕克研究中心（Max Delbrück Center）生物信息学研究的带头人。

 

2006 年他回国的时候，Nature 还做过特别的报道，副标题就是 Physicist-turned-bioinformatician heads back to Germany。2008 年，他成为柏林医学系统生物学研究所的学术所长。

 

对于这种超高难度的跨界，Nikolaus Rajewsky 的态度是：What field of science you belong to depends on what questions you're asking。

 

再提一下 Nikolaus Rajewsky 所在的马克斯 • 德尔布吕克研究中心（Max Delbrück Center），以马克斯 • 德尔布吕克命名的。马克斯 • 德尔布吕克（Max Delbrück）是一位德裔美籍生物物理学家，1969 年因为噬菌体方面的杰出研究与阿尔弗雷德 • 德 • 赫希（Alfred Day Hershey）以及萨尔瓦多 • 爱德华 • 鲁利亚（Salvador Edward Luria）共同获得诺贝尔生理学或医学奖。

特别说明：第一段中关于凯库勒的故事有想象成分，此外凯库勒在苯的六元环发现过程中的贡献还有争议。

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本文转载自微信公众号【Epigenetics表观遗传学】