SELECT-m6A单位点定量检测技术自问世以来，非常火爆，使用了该技术的研究也陆续见刊，其中不乏高分文章。今天，Epi老师就通过其中一篇文章，跟大家分享SELECT技术的更多应用。

m6A修饰的功能研究，离不开三种甲基化相关的酶（老生常谈Writers、Erasers、Readers，见图1），所以目前的研究主要都集中于这几种相关基因/蛋白。其中，METTL3/METTL14复合物具有催化m6A修饰的作用，关于METTL3/METTL14对于细胞质中mRNA的调控研究更是数不胜数，但是METTL3是否参与以及如何参与调控染色质功能的研究相对较少。

 

图1. Writers（甲基转移酶）、Erasers（去甲基酶）、Readers（m6A结合蛋白）Nombela et al. Molecular Cancer (2021)

2021年1月，来自复旦大学生物医学研究院的研究团队在Nature发表了题为METTL3 regulates heterochromatin in mouse embryonic stem cells的研究成果。这篇文章研究的机制包括了染色质组蛋白修饰H3K9me3和H4K20me3以及m6A修饰，发现METTL3对m6A修饰的催化，对小鼠干细胞异染色质的完整性十分重要。

 

 

ChIP-seq发现组蛋白修饰与METTL3相关

一开始，研究者通过ChIP-seq技术发现METTL3在染色质上与异染色质修饰H3K9me3、H3K20me3在染色质上共定位，呈现很强的正相关；进一步的分析发现METTL3主要结合在内源性逆转录病毒（Endogenous retrovirus）IAPEz转座子亚群上。

通过构建Mettl3敲除细胞系以及METTL3 WT和METTL3 APPA酶活突变体挽救细胞等试验， 研究者发现敲除后METTL3结合位点的H3K9me3/H4K20me3水平显著降低，并且这种降低可以被METTL3 WT挽救，而不能被METTL3 APPA挽救，提示METTL3调控异染色质依赖于m6A修饰。

 

m6A修饰调控可变剪切？还是调控RNA稳定性？

那么m6A修饰是通过什么机制调控IAPEz元件的呢？从图1可以看到，常见的m6A修饰调控机制有：调控基因可变剪切（Splicing）、RNA稳定性（Stablity）、基因翻译效率（Translation）等。这些可以通过以下技术进行研究：

mRNA上的m6A修饰主要通过YTHDF1/2/3蛋白促进RNA降解（即调控RNA稳定性），研究者为了探究降解途径是否也参与IAPEz RNA的转录后修饰，进行了RNA半衰期实验（研究RNA稳定性），发现IAPEz RNA的半衰期在Mettl3 敲除以后并没有显著变化，而对照mRNA Nxt1的半衰期则显著上升，提示METTL3调控IAPEz RNA含量主要通过转录调控， 而不是转录后调控。研究者进一步分析了公共数据库的Ythdf1/2/3敲除细胞的RNA-seq数据，也发现IAPEz RNA的含量不会随着Ythdf1/2/3敲除而上升，进一步支持m6A修饰不是通过转录后调控来促进IAPEz的降解。

 

meRIP-seq发现m6A修饰集中于IAPEz

接下来，研究者使用meRIP-seq确定全转录组的m6A修饰图谱，发现在Mettl3 KO细胞中，编码基因的mRNA 3′端m6A富集被消除：

 

 图2. IAPEz-int转录本上的m6A修饰：母细胞（parental cell）和Mettl3 KO细胞编码基因上的m6A平均富集水平;

 

 

图3. IGV峰图显示m6A富集于编码基因3’端，但敲除Mettl3后的细胞中就没有富集了。

 

值得注意的是，依赖于IAP转录本的METTL3的m6A在其5′端而非3′端特异性富集（104个m6A峰定位于86个IAPEz元件）：

 

图4. 母细胞、mettl3 KO细胞和Setdb1 cKO细胞的m6A修饰在RNA结构上的分布情况

 

SELECT检测低表达转录本的m6A修饰单位点

考虑到meRIP–seq对表达水平低的转录本（比如IAPEz）的m6A修饰检测能力可能有限，而IAPEz RNA含量在Setdb1（H3K9me3甲基转移酶）敲除细胞可以大幅度上升，为了排除meRIP实验中使用的m6A抗体引起的潜在偏差，研究者使用SELECT验证了IAPEz-int共有序列5′端的五个腺苷位点上的m6A修饰：

 

 图5. SELECT结果显示母细胞和Mettl3 KO细胞的IAPEz-int共有序列腺苷位点上的m6A修饰

 

H3K9me3修饰与m6A修饰共同参与调控机制

研究者通过ChIP-qPCR发现METTL3和YTHDC1在染色质上有很好的共定位，YTHDC1结合染色质依赖于RNA的m6A修饰，失去m6A结合能力的YTHDC1的突变株在染色质的富集水平也会大幅度丢失，进一步支持YTHDC1结合染色质依赖于m6A修饰的假设。研究者还发现甲基催化酶SETDB1反过来也可以促进METTL3和YTHDC1在IAPEz转座子元件的富集。

  

图6. 此研究发现METTL3可以结合小鼠胚胎干细胞ERV中的IAPEz转座子，通过招募SETDB1/TRIM28维持IAPEz转座子上的异染色质状态

 

已发表的SELECT应用文章（部分）

[1] Xu W, Li J, He C, et al. METTL3 regulates heterochromatin in mouse embryonic stem cells[J]. Nature, 2021, 591(7849): 317-321.（本文原文）
[2] Zhang, Z., Chen, T., Chen, HX. et al. Systematic calibration of epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library. Nat Methods, 2021,18, 1213–1222.[3] Worpenberg L, Paolantoni C, Longhi S, et al. Ythdf is a N6-methyladenosine reader that modulates Fmr1 target mRNA selection and restricts axonal growth in Drosophila. EMBO J. 2021 Feb 15;40(4):e104975. [4] Dong L, Mao Y, Zhou A, et al. Relaxed initiation pausing of ribosomes drives oncogenic translation. Sci Adv. 2021 Feb 17;7(8):eabd6927.[5]Wang Y, Xiao Y, Dong S, et al. Antibody-free enzyme-assisted chemical approach for detection of N 6-methyladenosine[J]. Nat Chem Biol, 2020, 16(8): 896-903.
[6] Liu X M, Zhou J, Mao Y, et al. Programmable RNA N 6-methyladenosine editing by CRISPR-Cas9 conjugates[J]. Nat Chem Biol, 2019, 15 (9): 865-871.[7] Xiao Y, Wang Y, Tang Q, et al. An Elongation- and Ligation-Based qPCR Amplification Method for the Radiolabeling-Free Detection of Locus-Specific N6 -Methyladenosine Modification. Angew Chem Int Ed Engl. 2018 Dec 3;57(49):15995-16000.

 

SELECT-m6A修饰单位点定量检测

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