非编码RNA研究
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LongRNA-seq(circRNA+lncRNA+mRNA)
发布时间:2018-03-05 16:28:20 | 浏览次数:


项目简介

 LongRNA-seq是一种全面检测细胞和组织长片段RNA>200nt 的转录组测序方法,包括线性的mRNAlncRNA分子,以及环状RNA,可准确高效揭示转录组的表达全貌,是非编码RNA的重要研究技术。

 

       关于长链非编码RNA(Long non-coding RNAlncRNA):

 lncRNA是一类长度大于200nt,无典型开放阅读框(ORF)RNA,其数量远高于编码蛋白质的mRNA。它们的基因背景很丰富,可以是由启动子、增强子起始的序列,基因内含子,RNA的反义链,亦或是基因之间的序列等。研究发现lncRNA可在表观遗传学水平(包括DNA 甲基化、组蛋白修饰、染色质重构)、转录及转录后水平调节基因的表达,从而参与各种基本生命活动和疾病的发生发展过程。

 

       关于环状RNAcircular RNAcircRNA):

 环状RNA是一类特殊的RNA分子,是RNA领域最新的研究热点。

与传统的线性RNAlinear RNA,含5’和3’末端)不同,circRNA分子呈封闭环状结构,不受RNA外切酶影响,表达更稳定,不易降解。在功能上,近年的研究表明,circRNA分子富含microRNAmiRNA)结合位点,在细胞中起到miRNA海绵( miRNA sponge)的作用,进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用,升高靶基因的表达水平;这一作用机制被称为竞争性内源RNAceRNA)机制。通过与疾病关联的miRNA相互作用, circRNA在疾病中发挥着重要的调控作用。而最新的研究发现,还存在大量的环形RNA可作为信使RNA来编码蛋白,这些环形信使RNA通过一种常见的RNA甲基化修饰m6A,来驱动非帽依赖性的翻译机制来合成蛋白质。

 正常情况下,真核细胞中蛋白质合成的主要方式是通过5’端帽依赖性翻译,但在应激环境下或一些癌症中,5’端帽依赖性翻译会被抑制而非帽依赖性翻译将会取代。因为环状RNA没有5’端帽结构,所以所有的环状RNA翻译都是通过非5’端帽依赖性翻译进行的。因而环状RNA可能通过产生刺激诱导蛋白在细胞应激反应中发挥重要作用。根据类似推理,环状RNA编码的蛋白可能在癌症等重大疾病发展过程中发挥重要作用。

 

实验流程


样本要求

1. 组织:>1mg;(仅限人源)

2. 细胞培养:1*106次方个;(仅限人源)

3. 血液样品:≥2ml。(仅限人源)

4.  RNA样品(仅限人源):

浓度≥ 200ng/μL,总量≥4μg

OD260/280介于1.8~2.2之间,OD260/2302.0RIN6.528S:18S1.0,确保RNA无降解;


建库方式

rRNA 链特异性建库方式

 

测序参数

测序平台:HiSeq X10/4000

测序模式:PE150测序模式

测序数据:>10G clean data

 

生物信息基础分析
1. 数据质控
2. 基因比对与统计
3. mRNA差异表达分析

4. lncRNA差异表达分析

5. 环状RNA预测分析
6. 环状RNA注释
7. 环状RNA差异表达分析
8. 差异基因GO分析
9. 差异基因KEGG分析
10. 生物学重复样品间相关性分析


 
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