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新型CLIP技术让RBP-RNA互作研究化繁为简
发布时间:2018-03-05 16:38:19 | 浏览次数:


 紫外交联免疫共沉淀(CLIP)是一种用于研究RNA结合蛋白(RNA bindingprotein, RBP-RNA互作关系的技术。通过将此技术与高通量测序(CLIP-Seq)结合,可以在全转录组范围内鉴定出特定RBP-RNA互作网络,对于RNA转录后调控研究意义非凡。

 CLIP技术首先利用紫外照射将RBPRNA耦联,再使用RNaseRNA分子打断,使用RBP抗体捕获RBP-RNA复合体,再对复合体中RNA分子5’端进行放射性元素标记,通过放射自显影即可将RBP耦联的RNA区域特异性分离出来,经过建库测序即可判断RBPRNA分子中结合区域。


CLIP流程图图片来源: Methods, 2005, 37(4): 376-386


 目前CLIP技术存在很多限制,无法报告RNA 3’端文库接头是否连接成功。放射性标记物的衰减会引起放射自显影信号变化,影响RBP结合区域捕获特异性等,想要做好CLIP并非易事。在20164月,美国斯坦福大学研究者在Nature Method报道了一种名为irCLIP的改进型的CLIP技术,克服了目前CLIP的不少缺点,成为一项重要研究成果。
       在这项研究中,研究者采用S1核酸酶及RBP抗体包被的磁珠进行紫外交联后的RNA分子打断,同时设计了一种近红外荧光染料IR800与生物素共轭的寡核酸接头,连接到被捕获的RBP-RNA复合体中RNA3’端,不再使用放射性元素对复合体进行标记,也不再需要长时间的放射自显影,只需要不到10分钟的荧光成相及硝酸纤维素膜斑点杂交分析即可完成RBP结合区域的富集。在对复合体进行消化时,研究者选择SDS替换常用的尿素与蛋白酶K对复合体进行消化回收RNA。在后续测序文库构建过程中,研究者选择了一种名为thermostable group II intron reverse transcriptaseTGIRT)的逆转录酶用于RNA捕获后逆转录为cDNA。相比逆转录病毒的逆转录酶,这种酶保真性,热稳定性更好,使用TGIRT时只需要简单的调整文库构建流程就可以大幅提高cDNA反转录效率,非常有利于从低细胞数量中捕获RNA样本建库测序。

 为了验证irCLIP效率,研究者在HeLa细胞中对hnRNP-CPTBP1HuR三种RBP结合RNA进行了检测,并与已发表的这三种RBP CLIP数据进行了比较。结果表明,irCLIP与已有数据一致性很高,且即使在较低的2×105细胞量水平,irCLIP依然可以获得很多独有的测序信息。

 

 irCLIPCLIP进行了大幅改进,在保证捕获及后续测序可靠度的情况下,极大简化了CLIP操作与流程与时间。相信此项技术的推广,将为RBP-RNA作关系研究提供更多便利,帮助研究者更为简单地获得新的研究成果。

 相关文献:

 Zarnegar B J, Flynn R A, Shen Y, et al. irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions[J]. Nature methods, 2016.


 
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