三代单细胞免疫组库测序
项目简介
三代单细胞免疫组库测序
免疫组库(immune repertoire，IR)是指在任何指定时间，某个个体的循环系统中所有功能多样性B细胞和T细胞的总和。T/B细胞是适应性免疫系统的两大细胞群，细胞表面受体TCR/BCR存在一块区域叫互补决定区（Complementary Determining Region, CDR），包含CDR1、CDR2、CDR3，其中CDR3最高变，在抗原识别中起关键作用。免疫组库测序是通过多重PCR和高通量测序技术，分析编码CDR3区的DNA/RNA序列，获得机体的免疫特征
经典免疫组库研究方案
经典免疫组库测序是用多重PCR技术或5’RACE扩增决定B细胞受体（BCR）或T细胞受体（TCR）多样性的互补决定区（CDR3区），再结合高通量测序技术实现，但往往只能检测TCR和BCR一条链的序列信息，其扩增区域并不能得到全长CDR序列，且PCR扩增具有偏向性,B/T细胞的CDR3多样性会受到影响。
单细胞建库流程图
单细胞免疫组库研究方案
BD单细胞V(D)J测序是在BD Rhapsody™系统中利用刚性磁珠，在微孔中进行单细胞捕获过程使配套的成像系可以进行全程质控分析出细胞捕获率统计，捕获后的磁珠理论上可保存三个月。随后进行标准的建库。其技术原理的关键是利用自然沉降的方法，在特制的U型槽中捕获单个细胞，辅助偶联Cell lab以及UMI序列的刚性磁珠标记不同样品（Cell label标记单个细胞，UMI标记每个细胞内不同的RNA序列）。
单细胞V(D)J测序可以将TCR/BCR双链完美匹配，而且可以细化到单细胞水平，同时获得表达谱信息，但是一般单细胞测序和二代测序技术相结合，由于二代测序长度限制导致测序区域丢失V区上游序列信息，并不能够得到CDR3的全长mRNA序列。
三代单细胞免疫组库研究方案
PacBio 和Nanopore 公司分别通过光信号和电信号方式实现单分子测序，即第三代测技术（下简称三代测序）。三代测序技术具有超长读长（序列长度10-15kb左右），无PCR 扩增和无GC偏好性等特点，可以有效弥补二代测序读长短和高GC含量区域无法测序的局限。结合三代测序技术进行免疫组库研究可得到CDR3的全长mRNA序列。
由于BCR/TCR重链mRNA的全长在600-1000bp之间，二代测序显然并不能测到全长mRNA，三代测序能够测到BCR/TCR重链的全长mRNA，单细胞技术和三代测序技术相结合的免疫组库研究能够达到前人未达到的水平，我们推出两种三代单细胞免疫组库研究方案，如下右图所示：
技术参数
产品优势
一站式服务
提供三代单细胞全长免疫受体mRNA扩增、建库、测序、后续信息分析以及数据挖掘一系列全方位的服务。
有针对性的研究方法
对免疫组库的不同研究方向，针对性设计研究方案，利用不同技术组合达到理想的研究效果。
更丰富的分析结果
新增多种结果统计图表；
新增V/J基因频率分布统计、多样品聚类分析、共性分析、差异分析等评估指标。
数据分析
克隆群体特征分析
（A），V-J基因组合频率Circos图，每个颜色块代表一种基因，颜色块越宽，频率越高。色块间的连线代表一种V-J基因组合方式。
（B），克隆频率分布，横纵坐标分别为克隆数和克隆频率。
（C），克隆频率分布甜甜圈图。第一层为1个reads、2个reads及≥3 reads支持的克隆类型比例；第二层为≥3 reads支持的克隆类型中，top 20%、20%-40%、40%-60%、60%-80%、80%-100%克隆的累积频率分布；第三层为top5克隆类型的频率分布及对应的氨基酸序列。
（D），Top20 V基因频率组间分布柱状图。
分析内容
产品应用
抗体
抗体组库测序：采用抗体组库多样性分析表征健康状况
疫苗抗体筛选：三代全长测序分析特异病原诱发的B/T细胞全长免疫受体mRNA，开发人源化抗体。
群体疫苗反应评估：评价疫苗保护性能。
感染类疾病
病毒感染biomarker：采用三代单细胞V(D)J测序技术，分析病毒感染biomarker
感染过程中免疫动态变化：三代单细胞V(D)J测序可追踪感染过过程中免疫动态变化
药物作用机制：结合药物作用条件分析药物作用机制研究
移植
受体免疫重构：免疫组库多样性研究移植后个体受体免疫重构
排异反应：三代单细胞V(D)J测序可研究排异反应发生
免疫病
诊断biomarker：采用三代单细胞V(D)J测序技术，分析免疫病biomarker
免疫病病理研究：采用三代单细胞V(D)J测序技术，研究免疫病病理过程
药物作用机制：结合药物作用条件分析药物作用机制研究
肿瘤
肿瘤免疫治疗：捕捉肿瘤发生时免疫微环境的变化，寻找免疫治疗的靶点，从而辅助免疫治疗更好的抗击肿瘤。
肿瘤病理研究：肿瘤细胞是具有免疫原性的，会引起T淋巴细胞侵润到肿瘤组织中，分析肿瘤细胞免疫体系研究肿瘤病理过程
肿瘤异质性研究：单细胞测序可有效检测到肿瘤异质性的存在并研究
诊断和预后biomarker：多项研究表明肿瘤组织中浸润淋巴细胞的存在及数量与病人生存期相关，因此TIL也许可作为一种肿瘤预后的生物标记物，应用免疫组库技术研究诊断和预后。
TCR克隆异质性（ITH）与肺腺癌基因组和临床的相关性
参考案例1
肿瘤案例： TCR克隆异质性与新抗原异质性及肺癌复发的关系
研究目的：寻找免疫检查点（PD-1、CTLA-4）治疗疗效的biomarker
研究样本：11例未转移肺腺癌，共45 tumor regions (2 to 5 regions per tumor)
研究技术：WES、TCR sequencing
研究结果：病灶特有突变导致新抗原（neoantigen）的内部表达差异，因此，产生不同的免疫原性，形成了TIL克隆内部差异（TCR ITH）。TCR ITH（intratumor heterogeneity）高与术后疾病复发和低生存率有关。
（A）年龄与MOI相关性；
（B）新抗原与MOI负相关；
（C）复发的病人具有更高的TCR ITH（lower MOI）；
（D）MOI越高（TCR克隆多样性越低），病人的无病生存期（disease-free survival）越长。MOI：克隆重叠指数，范围0-1，0代表克隆完全不同，1代表克隆完全相同。
TCRβ可预测CMV感染状态
参考案例2
感染类疾病案例：TCRβ 序列特征可准确预测CMV感染状态
研究目的：确定是否可以用TCR特征预测CMV（巨细胞病毒）感染状态。
研究样本：群体1：共计666个样本，其中289个CMV阳性，352个CMV阴性，40个感染状态未知；群体2：120个验证样本。
研究结果：对289个CMV+和352个CMV-样本进行免疫组库测序，发现了CMV相关的TCRβ序列特征，并且利用TCRβ可以从666个研究样本和120个验证样本中，准确鉴定出CMV感染状态。研究还发现该群体的TCRβ与HLA-A或HLA-B显著相关
（a）CMV+和CMV-样本中unique TCRβ分布散点图。
（b）ROC曲线显示TCRβ作为CMV感染状态分类器的分类效果。其中虚线表示在群体1中的测试结果，短虚线代表群体1中的交叉验证效果，实线代表群体2中独立验证效果。每条线上的黑圈代表最大后验概率（MAP）的决定阈值。插入图表展示的是群体2中MAP分类效果，敏感度为0.90，特异性为0.89。
参考文献
[1] Reuben A , Gittelman R M , Gao J , et al. TCR Repertoire Intratumor Heterogeneity in Localized Lung Adenocarcinomas: An Association with Predicted Neoantigen Heterogeneity and Postsurgical Recurrence[J]. Cancer Discovery, 2017, 7(10):CD-17-0256.
[2] Emerson R O , Dewitt W S , Vignali M , et al. Immunosequencing identifies signatures of cytomegalovirus exposure history and HLA-mediated effects on the T cell repertoire[J]. Nature Genetics, 2017, 49(5):659-665.
[3] Spielmann G , Bollard C M , Bigley A B , et al. The effects of age and latent cytomegalovirus infection on the redeployment of CD8+ T cell subsets in response to acute exercise in humans[J]. Brain, Behavior, and Immunity, 2014, 39:142-151.
[4] Elham A , Carr A J , George P , et al. Single-Cell Map of Diverse Immune Phenotypes in the Breast Tumor Microenvironment[J]. Cell, 2018:S0092867418307232-.