重磅推出| mRNA m5C BS-seq技术服务,绘制单碱基分辨率m5C修饰图谱
项目简介
m5C是RNA甲基化修饰中丰度较低的一种类型,但在肿瘤中的研究进展已经引起了广泛关注。近年来,随着高通量测序技术的发展,可以在转录组中很好的识别对包括m5C在内的各种核苷酸甲基化修饰。m5C修饰可以影响RNA的稳定性、可变剪接、翻译和转录后修饰等多个方面,从而对基因表达和细胞功能产生影响。虽然有大量关于m5C在tRNA和rRNA中的数据,但由于mRNA的丰度较低,且缺乏有效的分离纯化技术,对其在mRNA中的作用知之甚少。
为了推动mRNA m5C修饰研究,表观生物最新推出单碱基分辨率的mRNA m5C BS-seq技术服务。该技术使用重亚硫酸盐对不含修饰的C进行处理,使其在PCR之后转换为T,而m5C修饰并不能进行该转换。结合体外合成全转录组无修饰RNA技术,在mRNA m5C BS-seq中加入IVT RNA作为负对照,得到高置信度的m5C位点,降低了检测结果中的假阳性率。
技术流程
分析内容
一、 质控及统计
1. 原始数据质控
2. 比对统计
二、 m5C修饰水平概览
1. m5C修饰平均水平统计
通过高通量测序和生物信息分析,识别甲基化富集的基因组区域。
2. m5C修饰位点的注释与基因元件分布情况
通过生物信息分析利用邻近基因对m5C进行注释。并根据注释信息,绘制m5C修饰在不同基因组特征上的比例图。
3. DMC修饰基因的功能富集
将鉴定出的DMC所修饰的基因,利⽤GO和KEGG数据库进⾏功能富集分析。对位于CDS区的Hyper-DMC和Hypo-DMC修饰的基因进⾏功能富集分析:① 对实验组相对于对照组甲基化⽔平升⾼的DMC(All-Hyper DMC)修饰的基因做功能富集分析;② 对实验组相对于对照组甲基化⽔平降低的DMC(All-Hypo DMC)修饰的基因做功能富集分析;富集分析采⽤Fisher检验,结合BH校正。富集分析结果包括表格和图⽚两部分,其中,表格为所有富集到的GO/KEGG条⽬,包括显著和不显著的。
4. 基于全转录组组甲基化图谱的聚类
各个样品之间甲基化水平的比较,同时对甲基化的位点进行聚类分析,以识别在甲基化模式上相似的样本或基因。
1. 差异甲基化位点(DMC)鉴定与注释
识别两个/组样品间的差异甲基化位点,结合基因组注释信息中所有基因的位置信息及各个基因元件(5'UTR, CDS, intron, 3'UTR, ncRNA, tRNA)等位置信息,鉴定DMC与哪些基因的哪些基因元件有重叠,以此来判断DMC修饰哪些基因的哪些基因元件。
三、 m5C修饰修饰位点及注释
2. DMC 在染色体与基因元件上的分布情况
根据DMC的位置信息,统计DMC落在哪些染⾊体上,并⽤图形展示,以了解DMC在染⾊体上的分布有偏好性。同时根据DMC的位置信息,分别统计Hyper DMC及Hypo DMC 落在哪些基因元件上。
3. DMC修饰基因的功能富集
将鉴定出的DMC所修饰的基因,利⽤GO和KEGG数据库进⾏功能富集分析。对位于CDS区的Hyper-DMC和Hypo-DMC修饰的基因进⾏功能富集分析:① 对实验组相对于对照组甲基化⽔平升⾼的DMC(All-Hyper DMC)修饰的基因做功能富集分析;② 对实验组相对于对照组甲基化⽔平降低的DMC(All-Hypo DMC)修饰的基因做功能富集分析;富集分析采⽤Fisher检验,结合BH校正。富集分析结果包括表格和图⽚两部分,其中,表格为所有富集到的GO/KEGG条⽬,包括显著和不显著的。
样本要求
需要富集polyA mRNA
Total RNA:50ug
细胞:1.5*107
组织:25mg
测序数据量
10G/样本(免费赠送mRNA-seq 6G/样本)
40个工作日
项目周期
参考文献
Zhang Z, Chen T, Chen H X, et al. Systematic calibration of epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library[J]. Nature Methods, 2021, 18(10): 1213-1222.