PA-Ψ-seq
项目简介
假尿嘧啶（Pseudouridine，简称 Ψ）是 RNA 上常见的修饰类型，在 rRNA、tRNA 等 ncRNA 上的生物学功能已得到
广泛研究与报道，但由于缺乏在 mRNA 上检测 Ψ 修饰的技术，我们对 mRNA 的 Ψ 修饰功能尚不清楚。
表观生物新推出 PA-Ψ-seq[11]（photo-crosslinking-assisted Ψ sequencing，光交联辅助 Ψ 修饰测序），基于抗体对
Ψ 修饰进行精确定位，达到单核苷酸分辨率。
图 2-41. PA-Ψ-seq 技术流程
技术原理
将 RNA 片段化，利用 m1A 抗体进行免疫沉淀实验。洗脱 RNA 片段，反转录成 cDNA，进行高通量测序。
应用与优势
技术应用
1. 绘制全转录组的 Ψ 修饰图谱
2. 研究 Ψ 修饰对各种生理过程的调控机制
3. 研究肿瘤等疾病的 Ψ 修饰异常表达
技术优势
1. 光辅助技术将残基交联至同源抗体，特异性高
2. 分辨率高，达到单碱基水平
2. 分析内容丰富，多年 RNA 修饰技术经验
送样要求
样本物种： 仅限人、大小鼠，其他物种需评估
≥ 300μg/ 样本，RIN 值≥ 6
总RNA
≥ 300μg/ 样本，RIN 值≥ 6
细胞
≥ 150mg/ 样本
组织
分析内容
基本分析
1. 测序原始 reads 去接头 , 质量控制 (OC)
2. 参考基因组比对 (Mapping)
3. 富集区域鉴定 (PeakCalling)
4. 富集区域注释 (PeakAnno)
5. mRNA 修饰分析
6. 富集区域 metagene 图、pie 图、venny 图
7. Motif 分析
8. Peak 基因 GO 和 KEGG 分析
9. 差异 Peak 分析 ( 即差异 RNA 修饰 mRNA)
10. 差异 Peak 基因 GO 和 KEGG 分析
高级分析
1. 差异 RNA 修饰热图 (Heatmap)
2. 关联分析 ( 与 RNA-seq 关联分析或多组学关联分析 )
3. 关联分析热图 (Heatmap)
4. IGV 峰图 ( 附 5 个基因 )
图 2-42. 注释类型饼图
表观生物实测数据
图 2-43. IGV 基因峰图
图 2-48. 差异 Peaks 火山图
图 2-49. GO 差异 KEGG 分析气泡图
案例解读
假尿苷(ψ)是最常见的表观转录组修饰之一。研究者发现，假尿苷合成酶7(PUS7)在胶质母细胞瘤中高表达，并且高PUS7表达水平与胶质母细胞瘤患者较差的存活率相关。研究发现，PUS7表达和催化活性是胶质母细胞瘤干细胞(GSC)肿瘤发生的必要条件。
与对照细胞相比，作者检测到PUS7敲低细胞中小RNA群体的假尿苷水平显著降低，而在>200nt的RNA中未观察到显著变化（下图左）。假尿嘧啶测序在tRNA中检测到824个假尿苷位点（下图右）。
在PUS7敲低细胞中，tRNA-Arg-CCG-2-1第50位ψ显著减少（下图左、中）；而在肿瘤细胞GSC中，tRNA-Arg-CCG-2-1第50位ψ显著高于正常细胞NSC（下图右），说明tRNA-Arg-CCG-2-1第50位ψ受到PUS7调控。
为了弄清楚ψ的调控机制，作者通过将6x密码子与荧光素酶融合，构建了双荧光素酶报告系统，来测试tRNA的翻译（下图上）。tRNA-Arg-CCG的翻译效率在敲低PUS7的肿瘤细胞中显著增加（下图下左），而且tRNA-Arg-CCG翻译效率的提高可被野生型PUS7的过表达逆转，但失活的PUS7-D294A蛋白则不能逆转（下图下右）。这些结果表明，PUS7介导的tRNA假尿苷化抑制肿瘤细胞中的密码子特异性翻译。