TRAC-seq：tRNA m7G修饰测序
项目简介
你与最前沿的m7G研究，只差一个TRAC-seq
RNA 甲基化修饰 m7G（7- 甲基鸟嘌呤），是 tRNA 上最丰富的修饰类型之一，与 tRNA 稳定性和肿瘤等人类疾病密切 相关。TRAC-seq（m7G tRNA Reduction and Cleavage-Sequence），即 m7G tRNA 还原和断裂测序，系基于 AlkB 去甲基化酶的 tRNA m7 G 修饰研究方法，无需抗体，高效完成单核苷酸分辨率的 tRNA m7 G 修饰图谱绘制。
应用与优势
技术应用
1. tRNA转录组全局m7G修饰定位
2. 研究METTL1-WDR4甲基化转移酶介导的tRNA稳定性等生理机制
3. 研究肿瘤等疾病的tRNA m7 G修饰异常表达，探究疾病发生发展机制
技术优势
1. 结合小RNA分离步骤，选取tRNA进行处理，针对性强
2. 去甲基化酶AlkB处理，极大提高tRNA反转录效率，获
得完整tRNA修饰图谱
3. 利用AlkB和NaBH4 还原步骤，无需抗体，结果无偏移、高效
4. 精确识别tRNA修饰，达到单核苷分辨率
分析内容
1. 测序原始reads去接头，质量控制（QC）
2. 参考基因组比对（Mapping）
3. 化学剪切鉴定
4. tRNA m7 G鉴定
4.1 表达定量 4.2 差异分析
4.3 motif分析 4.4 关联分析
技术原理
提取小 RNA，细菌去甲基化酶 AlkB 处理，去除大部分tRNA 修饰，然后 NaBH4和苯胺处理，诱导 m7 G修饰位点的 RNA 骨架的还原和断裂。具有规则的 3’端的切割产物加上接头，建库测序
送样要求
细胞，≥ 2×107 个细胞/ 样本
样本类型
组织，≥ 50mg/ 样本
总RNA，≥ 100μg/ 样本，RIN 值≥ 6
仅限人、大小鼠，其他物种需评估
样本物种
表观生物实测数据
参考案例
Mol Cell：m7G tRNA修饰增强致癌mRNA翻译，促进肝内胆管癌发展[1]
该研究首先通过对 TCGA 数据库中 22 种 tRNA 修饰酶表达分析发现，tRNA m7G 修饰相关的 METTL1 在肝内胆管癌（ICC）中表达显著上调；通过 TRAC-seq，发现 METTL1 敲除后，ICC 中的 m7G 修饰丰度减少，其修饰的 tRNA 表达水平也明显下降（RNA-seq）；进一步利用 Ribo-seq 发现敲除 METTL1 后，影响基因翻译，表明 METTL1 介导的 tRNAm7 G 修饰具有调控 tRNA 水平和细胞翻译的功能。后续深入的机制研究表明，ICC 细胞可以通过 m7 G tRNA 解码的密码子频率偏倚机制，选择性调控了包括 EGFR 信号、细胞周期在内的多种相关癌基因的翻译，进而促进 ICC 的进展。
图2 结构域的解析
参考文献
[1] Dai Z, Liu H, Liao J, et al. N7-Methylguanosine tRNA modifification enhances oncogenic mRNA translation and promotes intrahepatic
cholangiocarcinoma progression. Mol Cell. 2021 Aug 19;81(16):3339-3355.e8.