RNA甲基化是表观遗传学的重要内容之一，其中m⁶A是较为常见的一种修饰方式，在转录后调控中发挥作用，包括调控基因表达、剪接、RNA编辑、RNA稳定性、控制mRNA寿命和降解、介导环状 RNA翻译^[1]等方面，因此，RNA甲基化修饰的相关研究已成为当前生命科学领域最热门的方向之一。

       和细胞内的RNA/DNA一样，外泌体内的RNA/DNA也存在着甲基化修饰^[2]，且细胞本身的甲基化状态变化影响着外泌体成分，肿瘤细胞来源的外泌体中还含有肿瘤相关的DNA甲基化^[3]，有望成为外泌体液体活检肿瘤标志物。另一方面，近年来关于外泌体DNA甲基化的研究表明，外泌体可通过传递DNA甲基化或去甲基化相关因子调控受体细胞DNA甲基化，从而参与疾病的发生发展、组织再生、免疫调节以及器官形成等^[4-5]。

       表观生物把握表观遗传学与外泌体研究先机，率先推出外泌体RNA甲基化meRIP-seq整体高通量测序服务，两大热点相结合，提升研究高度和广度，深入揭示生理病理机制，挖掘外泌体液体活检潜在RNA甲基化疾病标志物！

技术应用

1.       绘制外泌体全转录组m⁶A修饰图谱；

2.       比较正常人血浆外泌体与患者血浆外泌体的RNA甲基化情况，筛选疾病标志物；

3.       研究（干）细胞上清外泌体RNA甲基化对受体细胞的作用机制；

4.       研究肿瘤细胞分泌外泌体对微环境的影响机制

项目流程

外泌体提取→外泌体RNA提取→ meRIP实验 →微量文库制备和测序

技术原理

表观生物采用来源于德国 QIAGEN 公司的独家技术——QIAGEN exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit 提取外泌体 RNA，广泛兼容细胞培养基上清、血清血浆及其他体液样本，能够在 20 分钟内快速纯化得到细胞外囊泡，一个小时内纯化得到外泌体 total RNA 分子，为后续 RNA 功能研究奠定基础。

甲基化RNA免疫共沉淀（methylated RNA Immunoprecipitation，meRIP）基于抗体特异性结合甲基化修饰的碱基的原理，以RNA免疫共沉淀富集甲基化修饰片段为基础，然后通过高通量测序，在全转录组范围内研究发生甲基化的RNA区域，高效获得结果。

图1. 微量meRIP实验流程图

送样要求

样本类型：人血浆样本≥8mL

                细胞培养上清≥60ml

测序方案

测序平台：Illumina Nova Seq 6000

测序模式：PE150

测序数据：12G

基本分析内容 
1、 原始数据过滤及质控
2、参考基因组比对
3、Reads在染色体上的分布
4、Peak Calling 分析
5、Peak 可视化
6、Peak 统计分析
7、m⁶A 的基本特征
    7.1 peak 在基因元件的分布
    7.2 reads 在基因元件的分布
    7.3 Peak 关联基因的特征 
8、差异m⁶A修饰位点分析

9、差异m⁶A修饰相关编码蛋白基因GO，KEGG分析 

10、差异m⁶A修饰相关lncRNA分析
11、 motif分析 

高级分析内容
RNA-seq表达差异与m⁶A修饰差异关联分析

RNA可变剪切与m⁶A修饰差异关联分析

实测数据

图2. 表观生物微量meRIP-seq结果，显示meRIP数据在3’ UTR有显著富集

图3. 实测数据显示m⁶A修饰位点富集于转录终止区域

图4. 实测数据显示某特定基因的m⁶A修饰区域

参考文献：

1. Zhou C, Molinie B, Daneshvar K, et al. Identification and characterization of m6A circular RNA epitranscriptomes[J]. bioRxiv, 2017: 115899.

2. Thakur BK, Zhang H, Becker A, et al. Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection. Cell Res. 2014 Jun;24(6):766-9.

3. Yamamoto H, Watanabe Y, Oikawa R, et al. BARHL2 Methylation Using Gastric Wash DNA or Gastric Juice Exosomal DNA is a Useful Marker For Early Detection of Gastric Cancer in an H. pylori-Independent Manner. Clin Transl Gastroenterol. 2016 Jul 21;7(7):e184.

4. Shen N, Jiang L, Li Q, et al.The epigenetic effect of microRNA in BCR-ABL1 positive microvesicles during the transformation of normal hematopoietic transplants[J]. Oncol Rep,2017,38(5): 3278-3284.

5. Hayashi T, Lombaert IM, Hauser BR, et al. Exosomal MicroRNA Transport from Salivary Mesenchyme Regulates Epithelial Progenitor Expansion during Organogenesis. Dev Cell. 2017 Jan 9;40(1):95-103.