蛋白相分离系列技术服务
项目简介
2009年，Science的一项研究提出“相分离”（phase separation）这个概念[1]；而近几年的研究表明，液-液相分离（LLPS：liquid-liquid phase separation）可能是细胞形成无膜细胞器的物理化学基础，普遍存在于细胞各项生理过程中，比如某些转录调控的超级增强子等；在肿瘤、神经退行性疾病等疾病的发生发展过程中也起着非常重要的作用[2]，已经成为生命科学领域研究的热点，相关的文章近年来呈现井喷似的增长。
表观生物根据Cell等权威杂志发表的相分离体内体外实验设计方法指南[3]，推出了以下一系列完备的蛋白相分离技术服务，包括相分离形成能力预测、相分离形成能力鉴定、相分离功能验证。
例图1
一、蛋白相分离形成能力预测
蛋白相分离形成能力预测
通过生物信息学的前沿算法，可以对蛋白相分离形成能力进行一个初步的预测。
内容：利用机器学习建立的PSPHunter算法，基于蛋白氨基酸序列，整体预测蛋白相分离形成能力（赋分0.8以上为高成相能力蛋白）
二、蛋白相分离形成能力验证
细胞中最为常见的相分离是液态相分离结构。目前相分离研究领域认为[4]，鉴定相分离，需要以下的实验证明：
1. FRAP
2. 结构大小是否达到或接近微米级别
3. 活细胞成像
4. 体外重构
有鉴于此，表观生物推出了以下的蛋白相分离形成能力验证实验服务：
例图2
免疫荧光染色检测蛋白活细胞分布
内容：通过免疫荧光染色，检测目的蛋白的活细胞分布以及聚集情况。可同时检测两个蛋白的活细胞分布以及共定位情况（需要客户提供细胞以及目的蛋白抗体）
相分离荧光载体构建
内容：
（1）通过无缝克隆构建目的蛋白融合荧光蛋白（EGFP/RFP）的真核表达载体，可用于活细胞观察目的蛋白的相分离形成情况。
（2）通过无缝克隆构建目的蛋白融合荧光蛋白（GFP/mCherry）的原核表达载体，可用于原核表达纯化融合荧光的目的蛋白用于体外成相实验
例图3
原核表达纯化及蛋白体外成相实验
2012年，美国西南医学中心的研究团队发现在试管中分子通过微弱的作用力形成液滴，首次证实了相分离能够通过简单的生化实验在体外重复[5]。因此，相分离可以在体外通过纯化的蛋白以及核酸等在特定的条件下发生，体外重构的相分离实验对于该领域具有重要的作用。
内容：原核表达融合His-Tag以及荧光Tag的目的蛋白，经过镍柱亲和纯化，获得高纯度的目的蛋白。摸索适合的体外成相条件，观察目的蛋白的体外成相情况
例图4
蛋白融合荧光细胞系构建以及活细胞成相实验
内容：将目的蛋白融合荧光蛋白（EGFP/RFP）真核表达载体转染至目标细胞中，经过药物筛选构建稳定表达细胞系。利用构建成功的细胞系进行激光共聚焦活细胞成像，观察目的蛋白在细胞内成相情况
例图5
体外FRAP
荧光漂白恢复实验（fluorescence recovery after photobleaching，FRAP）常用于测量液滴的流动性，看所研究的蛋白是否在短时间内恢复荧光，这可以表明此种结构是否与周围环境在进行频繁的物质交换，辅助验证相分离。
内容：蛋白在体外体系形成相分离后，使用激光共聚焦显微镜观察相分离液滴经过光漂白之后，液滴淬灭区域荧光恢复情况，由此验证蛋白体外相分离液滴的流动性
例图6
细胞内FRAP
一个相分离结构验证标准：形成球状结构，能够融合，通过FRAP技术可证明其能够发生荧光漂白恢复。
内容：对于活细胞内形成的相分离液滴，使用激光共聚焦显微镜观察相分离液滴经过光漂白之后，液滴淬灭区域荧光恢复情况，由此验证细胞内相分离液滴的流动性
例图7
体外相分离融合及分裂
内容：蛋白在体外体系形成相分离后，使用激光共聚焦显微镜长时间拍摄模块，观察相分离液滴的融合及解聚现象，由此验证体外相分离液滴的流动性
例图8
细胞内相分离融合及分裂
活细胞成像实验，目的是观察液滴融合或分离现象。
内容：对于活细胞内形成的相分离液滴，使用激光共聚焦显微镜长时间拍摄模块，观察相分离液滴的融合及解聚现象，由此验证细胞内相分离液滴的流动性
例图9
三、蛋白相分离功能验证
蛋白关键相分离位点预测
内容：利用机器学习建立的PSPHunter算法，基于蛋白氨基酸序列，识别蛋白的关键相分离驱动氨基酸区段
例图10
蛋白成相突变体以及突变回补体构建及成像验证
为了验证相分离对于蛋白功能的直接影响，我们通常需要在破坏蛋白成相能力以及回补其成相能力之后，进行功能性的验证。
内容：在获得蛋白关键成相位点信息之后，在避开蛋白重要的功能性结构域的前提下，对于蛋白关键成相位点设计突变，破坏其相分离形成能力，并且通过融合表达已知具有相分离形成能力的蛋白无序区短肽（例如FUS IDR、hnRNPac1 IDR、polyG等）进行成相能力回补。而后，通过构建相关真核及原核表达载体，并且在细胞内以及体外对于成相突变体的成相能力进行验证
四、蛋白与蛋白相互作用促进相分离功能验证
体外X蛋白促进Y蛋白相分离
材料：X蛋白、Y蛋白、纯荧光蛋白对照
范例：RYBP体外促进CTCF相分离
（Wei et al., Cell Res., 2022）
注： S表示上清，p表示沉淀下来的相分离
体外X蛋白促进Y蛋白相分离沉淀实验
范例：RYBP体外促进CTCF相分离沉淀实验
（Wei et al., Cell Res., 2022）
参考文献
1. C. P. Brangwynne et al., Germline P granules are liquid droplets that localize by controlled dissolution/condensation. Science 324, 1729-1732 (2009).
2. S. F. Banani, H. O. Lee, A. A. Hyman, M. K. Rosen, Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nat Rev Mol Cell Biol 18, 285-298 (20 17).
3. M. Kato et al., Cell-free formation of RNA granules: low complexity sequence domains form dynamic fibers within hydrogels. Cell 149, 753-767 (2012).
4. Berry, J et al., Physical principles of intracellular organization via active and passive phase transitions. Reports on Progress in Physics, 81(4), 046601(2018).
5. P. Li et al., Phase transitions in the assembly of multivalent signalling proteins. Nature 483, 336-340 (2012).