新型CLIP技术让RBP-RNA互作研究化繁为简

2018-03-05

紫外交联免疫共沉淀（CLIP）是一种用于研究RNA结合蛋白（RNA bindingprotein, RBP）-RNA互作关系的技术。通过将此技术与高通量测序（CLIP-Seq）结合，可以在全转录组范围内鉴定出特定RBP-RNA互作网络，对于RNA转录后调控研究意义非凡。

CLIP技术首先利用紫外照射将RBP与RNA耦联，再使用RNase将RNA分子打断，使用RBP抗体捕获RBP-RNA复合体，再对复合体中RNA分子5’端进行放射性元素标记，通过放射自显影即可将RBP耦联的RNA区域特异性分离出来，经过建库测序即可判断RBP在RNA分子中结合区域。

CLIP流程图图片来源: Methods, 2005, 37(4): 376-386

目前CLIP技术存在很多限制，无法报告RNA 3’端文库接头是否连接成功。放射性标记物的衰减会引起放射自显影信号变化，影响RBP结合区域捕获特异性等，想要做好CLIP并非易事。在2016年4月，美国斯坦福大学研究者在Nature Method报道了一种名为irCLIP的改进型的CLIP技术，克服了目前CLIP的不少缺点，成为一项重要研究成果。
在这项研究中，研究者采用S1核酸酶及RBP抗体包被的磁珠进行紫外交联后的RNA分子打断，同时设计了一种近红外荧光染料IR800与生物素共轭的寡核酸接头，连接到被捕获的RBP-RNA复合体中RNA的3’端，不再使用放射性元素对复合体进行标记，也不再需要长时间的放射自显影，只需要不到10分钟的荧光成相及硝酸纤维素膜斑点杂交分析即可完成RBP结合区域的富集。在对复合体进行消化时，研究者选择SDS替换常用的尿素与蛋白酶K对复合体进行消化回收RNA。在后续测序文库构建过程中，研究者选择了一种名为thermostable group II intron reverse transcriptase（TGIRT）的逆转录酶用于RNA捕获后逆转录为cDNA。相比逆转录病毒的逆转录酶，这种酶保真性，热稳定性更好，使用TGIRT时只需要简单的调整文库构建流程就可以大幅提高cDNA反转录效率，非常有利于从低细胞数量中捕获RNA样本建库测序。

为了验证irCLIP效率，研究者在HeLa细胞中对hnRNP-C、PTBP1和HuR三种RBP结合RNA进行了检测，并与已发表的这三种RBP CLIP数据进行了比较。结果表明，irCLIP与已有数据一致性很高，且即使在较低的2×10⁵细胞量水平，irCLIP依然可以获得很多独有的测序信息。

irCLIP对CLIP进行了大幅改进，在保证捕获及后续测序可靠度的情况下，极大简化了CLIP操作与流程与时间。相信此项技术的推广，将为RBP-RNA互作关系研究提供更多便利，帮助研究者更为简单地获得新的研究成果。