Ribo-seq
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Ribo-seq核糖体印迹测序服务
发布时间:2018-05-24 13:02:20 | 浏览次数:

项目简介

             蛋白质是生命活动的主要承担者。根据中心法则,从基因组生成整个蛋白质组需要有RNA生成调控(含表观遗传调控和转录调控)、RNA降解调控、蛋白质生成调控(即翻译调 控)、蛋白质降解调控这四个主要调控阶段。其中, 翻译调控占所有调控比例的一半以上,超过其他所有调控的总和,是细胞内最重要的调控方式[1]。翻译组学针对的是对生命过程全局性研究的主要矛盾,从翻译组学的角度研究问题,可谓是研究中心法则的生物核心信息流。

             Ribo-seq (Ribosome profiling),即核糖体印迹测序技术,系由Weissman课题组于2009年首次发表的翻译组学研究技术[2]。利用Ribo-seq,研究者能从基因组水平检测蛋白质的翻译状况,获得全面的、高质量的蛋白质翻译速度情况,了解蛋白质表达情况及其丰度;还能直接对翻译过程进行研究。

 

技术原理

             利用低浓度RNase处理核糖体—新生肽链复合物,降解没有核糖体覆盖的mRNA片段,随后再去除核糖体,通过二代测序技术检测被核糖体保护的约22~30 bp的RNA小片段 (称为ribosome footprints,RFPs;又称ribosome protected fragments,RPFs。两者等价),可得到核糖体分布的位置信息,据此可得到每种转录本上核糖体的分布、密度,可推测起始密码子位置(包括非ATG起始)、ORF(开放阅读框)位置、翻译暂停区域以及uORFs (上游开放阅读框)等信息[3]


 

图1. Ribo-seq实验流程图[4]

首先,用翻译抑制剂或液氮急冻处理细胞或组织。核酸酶处理,使不受保护的RNA降解。回收核糖体,通过序列大小选择性回收RFP片段,然后制备文库,进行二代测序。将reads与基因组比对,找到它们在核糖体的位置。

 

图2. Ribo-seq检测翻译延长速率的原理[4]

 (A) 翻译延长速率越慢,核糖体停留的时间越多;(B)细胞内所有组装好的核糖体的“快照”(snapshot);(C)核糖体足迹(footprints)密度越高的位点,表明翻译延长速率越慢。

 

技术应用

       联合longRNA-seq,研究转录本上正在进行的翻译情况,深入了解基因调控最重要层面:

● 了解转录本上的核糖体分布、翻译活性

● 推测翻译起始位点、ORF位置

● 确定蛋白翻译效率

● 探究翻译调控和基因表达情况

 

 

送样要求

样本类型:1. 活细胞样本,密度≥1×107

                2. 组织样本,质量≥300mg。

样本物种:仅限人、大小鼠,其他物种需评估。

 

样品分组

1. 常规要求至少2组样品,包括对照组和实验组(临床样本为正常人组和患者组)。

2. 每个样品均进行 Ribo-seq 和 longRNA-seq (采用去rRNA建库法)。

3. 样本数建议:3 VS 3。

 

测序方案

1. 测序平台:Illumina HiSeq X10/ Hiseq 4000/ BGI 500

2. 测序模式:SE 50

3. 测序数据量: 30M

 

 

分析内容


Ribo-seq组基本分析

对照longRNA-seq分析

  1、原始数据处理及统计

  1、数据质控

  2、过滤后数据质量QC

  2、基因比对与统计

  3、测序序列与参考基因组比对

  3mRNA差异表达分析

  4、基因组覆盖度分布

  4lncRNA差异表达分析

  5、全基因组翻译活性分析

  5差异基因GO分析

  6、基因翻译效率计算

  6差异基因KEGG分析

  7、差异翻译效率基因分析

  

  8、差异翻译效率基因GO分析


  9、差异翻译效率基因KEGG分析

  

  10、起始密码子预测(包括非ATG起始)

 

  11ORF(开放阅读框)位置预测

 

 

 

案例Cell—特异tRNA促进肿瘤转移[5]

该研究发现,在人类乳腺癌中,特殊的tRNAs:tRNAGluUUC 和tRNAArgCCG的表达水平上升会使细胞获得转移能力。研究者通过Ribo-seq检测这些特殊tRNAs增多后转录本上的核糖体结合情况,结果显示富集这些tRNA同源密码子的转录本更加稳定,核糖体结合更多。特别是tRNAGluUUC通过直接增强EXOSC2表达与增强GRIPAP1来构成一条受tRNA驱使的“可诱导”通路,从而促进癌症转移。

Ribo-seq检测tRNAGluUUC 和tRNAArgCCG上调后的转录后水平特征

(A)Ribo-seq文库的标志性特征:周期为3nt;(B)RPF长度为30nt;(C)Ribo-seq分析结果显示,在tRNAGluUUC 和tRNAArgCCG过表达的细胞中,核糖体结合增加,含GAR和CGG的基因显著富集;(D)质谱分析显示,在tRNAGluUUC过表达细胞中,GAG和GAA (GAR)丰度高的基因显著富集。

 

参考文献

[1]  Schwanhausser B, Busse D, Li N, et al. Global quanti- fication of mammalian gene expression control. Nature, 2011, 473(7347): 337-342

[2]  Ingolia NT, Ghaemmaghami S, Newman JR, et al. Ge- nome-wide analysis in vivo of translation with nucleo- tide resolution using ribosome profiling. Science, 2009, 324(5924): 218-223

[3]  Ingolia NT. Ribosome Footprint Profiling of Translation throughout the Genome. Cell, 2016, 165(1): 22-33

[4] Gobet C, Naef F. Ribosome profiling and dynamic regulation of translation in mammals. Curr Opin Genet Dev. 2017 Apr;43:120-127.

[5] Goodarzi H, Nguyen H C B, Zhang S, et al. Modulated Expression of Specific tRNAs Drives Gene Expression and Cancer Progression[J]. Cell, 2016, 165(6): 1416-1427.

 


 
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