RNA甲基化检测
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miCLIP-seq整体服务
发布时间:2018-07-26 18:03:11 | 浏览次数:

       miCLIP-seq,即m6A单碱基分辨率紫外交联沉淀(m6A individual-nucleotide-resolution cross-linking and immunoprecipitation)结合高通量测序,利用m6A抗体和紫外线交联,研究单碱基水平的m6A转录组图谱。

 现有的其他RNA m6A检测技术,比如meRIP和m6A-seq,是通过m6A特异抗体进行IP,然后高通量测序100nt左右的RNA片段,这些技术仅能对m6A位点进行一般定位,不能在特定的位点进行修饰残基的识别;此外,生物信息学上的m6A calling存在偏差:先验的结论基于已知的含有m6A的共有序列,这样会忽略掉存在于这些基序以外的修饰。

       miCLIP使用针对m6A的抗体,产生高选择性的标记:对紫外交联到抗体的RNA进行反转录,形成突变或者截断的cDNA,即表明存在结合蛋白。这项技术组合了RNA紫外交联和免疫沉淀技术,在活细胞中将蛋白质交联RNA,研究全转录组的RNA结合位点图谱,可精确识别m6A残基,分辨率达到单碱基水平。


技术原理



图1. miCLIP-seq技术流程

提取细胞RNA,切成片段,与anti-m6A抗体孵育。在254nm紫外线交联之后,抗体-RNA复合物共价结合,用protein A/G亲和提取回收,SDS-PAGE和硝化纤维膜印迹。用蛋白酶K将RNA从膜上释放,进行反转录。仍在RNA的多肽片段会导致核苷酸整合错误(表示为C→T转化)和cDNA截断。

 

技术应用

1. 绘制全转录组精确的m6A修饰图谱,达到单碱基分辨率级别;

2. 除了m6A,还可以鉴定m6m修饰;

3. 还能鉴定small RNA上的m6A修饰。

 

技术优势

1. 无需4-SU等修饰核苷酸预处理(PAR-CLIP需要)

2. 基于特征突变,准确预测m6A修饰

3. miCLIP对m6A的识别并不受峰形状影响,实现无偏鉴定

 

送样要求

样本类型:1. 活细胞样本,密度≥1×107 ;

                2. 总RNA样本,质量为100-150ug。

样本物种:仅限人、大小鼠,其他物种需评估。

 

样品分组

1. 常规要求至少2组样品,包括对照组和实验组(临床样本为正常人组和患者组)。

2. 样本数建议:3 VS 3。

3. 组内对照:IP组VS in put组*

注*:input组主要用于比较鉴定IP组的抗体特异性结合,是必备的组分

 

测序方案

1. 测序平台:Illumina HiSeq X10/Hiseq 4000

2. 测序模式:SE 50

3. 测序数据量: 40M

 

案例: Linder B. Nat Methods. 2015. 单碱基分辨率的m6A和m6Am全转录组图谱

 

图2. miCLIP-seq结果

miCLIP在单碱基分辨率识别ncRNA MALAT1上的m6A残基。3个SCARLET阴性位点聚集在110nt长的序列中,CIMS和CITS miCLIP-seq在准确识别两个SCARLER阳性位点的同时,并没有识别到中间的SCARLET阴性位点,显示出优秀的空间分辨率和低错误率。CIMS:交联诱导的突变位点;CITS:交联诱导的截断位点。

案例原文: Linder B, Grozhik AV, Olarerin-George AO, et al. Single-nucleotide resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nat Methods. 2015 Aug;12(8):767-72.

 
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